低溫常壓電漿於癌症治療、蛋白質薄膜沉積與牙科治療等醫學應用
Applying Low-temperature Atmospheric-pressure Plasma to Cancer Therapy, Protein Coating, and Tooth Therapy
隨著技術發展，低溫常壓電漿開始應用於生醫領域，其具有生成活性氮氧物質、觸及率佳、副作用小、可攜帶、成本低等優點，適合應用於牙科或皮膚科等醫療。本文介紹低溫常壓電漿的三種醫療應用。第一是用於牙齒美白，效果比美白膠好且牙釉質傷害小；第二是快速蛋白質沉積用於生物晶片製程，速度比共價鍵固定快且不需使用化學藥劑；第三是肺癌肋間膜轉移治療，發現電漿可選擇性抑制肺癌細胞且對良性細胞影響不大。
In recent years, the low-temperature atmospheric-pressure plasma (LTAPP) is applied to medical applications. It has several advantages including reactive oxygen species (ROS) generation, gaseous, low side effect, portable, and cost-effective, so it is very suitable for the dental or dermatology therapy. This article introduced three LTAPP medical applications. First is for tooth bleaching, the bleaching efficacy of LTAPP is better than H2O2 jet and the harm to enamel is less. Second is aerosol-assisted atmospheric-pressure plasma deposition. It takes about 5 mins and needs no chemicals to trap protein on the substrate for biosensor fabrication. Third is applying LTAPP for management of malignant pleural effusion. The result showed that, after plasma treatment, the CL1-5 cancer cell is inhibited, while the benign cells were not significantly harmed.
一、電漿概述
電漿 (plasma) 是大家都聽過，但是往往不知道怎麼描述的物質。電漿被稱為物質的第四態，換句話說，電漿難以用我們熟知的固態、液態、氣態三態物質的方式定義。電漿是物質的高能狀態，由離子、電子、中性的原子或分子所組成，大多數時候為一帶有等量正負電荷的離子化氣體，形狀和體積不固定且導電率佳，可受外加電場與磁場影響的流體物質。電漿中帶電粒子有自己的電場，在運動時也會產生磁場，電漿在電場與磁場作用時，可隨之變化其三維結構，同樣地，電場與磁場也可以用以加速、移動電漿中的粒子。我們可藉由外加能量以產生電漿，透過加熱或加電場使氣體內的電子獲得能量，電子隨之加速，電子加速後撞擊中性的原子或分子，中性粒子受電子的撞擊後，產生新的離子與新的電子，新的電子再被加速到具有足夠的能量會再撞擊解離其他的中性粒子，周而復始，使得大量的電子與離子產生，稱之為電子崩潰效應 (electron avalanche)，形成電漿態 (圖 1)。
圖 1. 氣體中之自由電子經電場或電磁場加速後撞擊氣體分子生成電子與離子，當電場達到崩潰電壓時，粒子撞擊重覆發生造成電子崩潰形成電漿。
宇宙中的已知物質 99% 以上是以電漿型態存在，最廣為人知的就是太陽，除了太陽以外，地球與太陽周圍星際空間也都是電漿；而地球上的電漿多分布在大氣層以上，我們日常生活所見的電漿應用大多是人工電漿，人工電漿的生成就如上所述的外加電場或電磁波，如：日光燈、電漿電視、工業用電漿系統和實驗室電漿等。磁場也會對帶電粒子產生影響，在沒有磁場的作用時，電漿中的帶電粒子受電場影響移動，但當有磁場作用時，帶電粒子會額外受磁場影響改變移動方向，例如當帶電粒子的移動方向與磁場方向垂直時，帶電粒子便會做圓周運動。除了上述的電漿應用領域外，隨著半導體產業的發展，電漿應用在半導體製程最廣為人知，電漿研究也在近十年來蓬勃發展，諸如生醫工程、環境工程、太空電漿、汽車工業…等，都能看到電漿扮演重要的角色，這也帶動了電漿物理的研究。
電漿溫度通常以凱氏溫標 (Kelvins, K) 或是電子伏特 (electron volt, eV) 為單位，主要呈現離子、電子進行熱運動時的能量。在電場的作用下，不同質量尺度的粒子可能會具有差異極大的溫度，比如電子間達到熱平衡 (thermal equilibrium) 的速度，可能會遠比於離子或原子達到熱平衡的速度快，此外也會有電子溫度 (electron temperature, Te) 遠高於離子溫度 (ion temperature, Ti) 的情形 (冷電漿，於後詳述)。
若依溫度區分電漿種類，可分為高溫電漿 (high-temperature plasma, HTP) 與低溫電漿 (low-temperature plasma, LTP)，其中低溫電漿又分為熱電漿 (thermal LTP) 與非熱電漿 (nonthermal LTP) 兩種，說明如下：
1. 高溫電漿
定義：離子溫度約等於電子溫度，二者溫度大於等於 107 凱氏溫度 (i.e. T ≈ Ti ≈ Te ≥ 107 K)，例如核融合電漿。
2. 低溫電漿
a. 熱平衡電漿
定義：整體溫度、離子溫度與電子溫度皆差異不大，三者處在熱平衡的狀態，該溫度低於 2,400 凱氏溫度 (約攝氏 2100 °C) (i.e. T ≈ Ti ≈ Te ≤ 2 × 104 K)，例如常壓電弧電漿。
b. 非熱平衡電漿，又稱冷電漿
定義：整體溫度與離子溫度熱平衡，該溫度約為室溫，約等於 300 凱氏溫度(約攝氏 27 °C) (i.e. T ≈ Ti ≈ 300 K，Ti ≪ Te ≈ 105 K)，但電子溫度約為 105 凱氏溫度，遠大於整體溫度，即電子溫度與整體溫度「非熱平衡」，又稱為弱解離化電漿 (weakly ionized plasma)。
電漿游離的程度取決於游離能 (ionization energy)，游離能則由電子溫度決定；當電漿近乎 100% 解離時稱之為「全離化」(fully ionized) 電漿，也稱「熱」電漿，反之，當只有極低比例 (例如 10 ppm) 的粒子解離時，則稱為「冷」電漿，此時電子溫度還是高達攝氏幾千度但電漿溫度可能接近室溫。
若依氣體壓力區分，可分為兩種，一為低壓電漿 (low pressure plasma, LPP)，即為真空電漿，壓力約為 1 mtorr－1 torr；另一為常壓電漿 (atmospheric pressure plasma, APP)，壓力為 760 torr (1 大氣壓)。
目前電漿技術廣泛應用在許多產業中，其中以在真空環境下的低壓電漿應用最為成熟，但需要用真空腔體和真空幫浦維持低壓的環境，不僅成本高、單位時間處理效率低，加上真空設備價錢高昂、真空腔體大小限制了受處理物體尺寸、需要抽取真空的時間等因素。因此，無上述限制的「常壓電漿技術」漸成為發展與研究方向，且常壓電漿技術具有操作成本低、操作速度快、易與其他設備組合提高生產效率等優勢，目前已使用在液晶顯示器、觸控面板、發光二極體等製程中。
本篇文章的探討領域著重於非熱平衡常壓電漿的原理與生醫應用，非熱平衡常壓電漿常也稱為低溫常壓電漿，之後內容以此名稱來介紹其原理與應用。
二、低溫常壓電漿的原理與應用優勢
1. 低溫常壓電漿的生成方法
電漿電源是電漿生成技術中的關鍵。若依所使用的電漿電源頻率區分，目前有直流放電 (DC)、低頻放電 (KHz)、中頻放電 (MHz)、射頻放電 (13.6 MHz)、微波放電 (2.45 GHz) 等方法。電漿溫度和電漿中的離子能量大致相關，若盡量在不加速離子的狀況下加速自由電子進行電漿解離，則可以讓生成電漿的溫度較低。常壓弱解離電漿中，電子電漿震盪頻率 (electron plasma frequency) 約在百 GHz 等級，而因為離子比電子重約一萬倍以上，因此離子的電漿震盪頻率也比電子低很多。若使用接近電子震盪頻率的電場，則可以有效加速電子而較少的加速質子，也就能使電漿溫度較低。另外解離反應時間約數十奈秒，加熱反應時間則約數百奈秒，因此若能在數十奈秒內施加能量進行解離，也可避免溫度上升。此外也可以使用增加氣體流量、插入介電質、加電阻限流等方式防止溫度上升。
低溫常壓電漿使用較高電壓與極低電流使氦 (He) 或氬 (Ar) 等氣體解離產生輝光放電，在適當控制電源參數與氣體種類比例的條件，所產生的電漿溫度接近人體溫度 (37 °C)，電漿與空氣中的氮、氧、水等分子反應會生成含有包含 •OH 氫氧自由基與 •NO 氮氧自由基等在內的活性氮氧物質 (reactive oxygen/nitrogen species, RONS)。不同的 RONS 對於人體有許多不同作用，而自由基對於人體的影響則是一個尚未完全被了解的有趣議題。
2. 低溫常壓電漿的應用優勢
在一大氣壓且室溫的環境下產生電漿是極具經濟與效率的方式，低溫常壓電漿相較於傳統的低壓電漿，有著更廣的應用領域。低溫常壓電漿可在室溫操作，電漿在氣體低溫時就可以破壞目標分子的鍵結形成不同的粒子，加上不需要抽取真空的腔體，使得低溫常壓電漿的設備得以設計成可攜式，也少了抽取真空的時間，因此開機時間也很短，使低溫常壓電漿的應用極適合延伸到生物與人體醫學上。
現階段低溫常壓電漿在生物醫學領域的應用很多，美、德、日、韓等國家都有很多相關的研究與新創公司成立，應用包含癌症治療、電漿刀 (plasma blade)、表面改質、電漿牙齒美白、電漿牙根管治療 (plasma canal sterilization)、傷口癒合、皮膚再生 (skin regeneration)、食物水果保存 、殺菌等。往後的篇章將針對筆者實驗室發展之電漿牙齒美白、電漿輔助聚合快速蛋白質包埋、電漿癌症治療等研究進行討論。
三、低溫常壓電漿在牙齒美白的應用
低溫常壓電漿可在室溫操作且不需要真空腔體，因此體積小具有可攜性，亦可直接以氣態形式接觸到患部，所以低溫常壓電漿在牙科應用中有極大潛力，牙齒美白是其中一個方向，以下將說明筆者實驗室的研究。
在氦氣常壓電漿束搭配生理食鹽水用於牙齒美白(1) 研究中，我們使用氦氣低溫大氣壓電漿束 (helium-based atmospheric pressure plasma jet, He-APPJ) 來達成牙齒美白效果，此方法可以避免臭氧 (O3) 和過氧化氫 (H2O2) 的人體危害。在這項研究中，使用三種方法：搭配食鹽水的氦氣流 (對照組，A 組)、市售 H2O2 牙齒美白凝膠 (B 組)、搭配食鹽水的 He-APPJ (C組) 處理牙齒樣品，其中以 He-APPJ 處理的美白功效在三組中最高。此外，掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM) 圖像顯示，用 He-APPJ 處理的牙釉質比用 H2O2 凝膠處理的牙釉質的損壞少得多。臭氧測試表明 APPJ 幾乎不產生臭氧 (< 0.35 ppm)。總之，與使用 H2O2 凝膠的方法相比，搭配食鹽水的 He-APPJ 具有更高的美白效果，並且傷害較小。
1. 牙齒美白成效說明
A、B、C 組的照片如下圖所示 (圖 2 的 (a) (b) (c))， 左邊為未處理前的牙齒照片，右邊依序為氦氣流， H2O2 凝膠， 和 He-APPJ 處理 20 分鐘後的牙齒照片。由照片中可以觀察到相較於 A 組，B 組及 C 組處理過後的牙齒都有變白的跡象，其中以 C 組的美白效果最為明顯。將三組經過不同處理後的平均美白強度 ΔE 量化後之結果如圖 3 所示，A 組的 ΔE 值約為 2.7，B 組的 ΔE 值約為 4.8，C 組的 ΔE 值約為 7.2，可得知使用 He-APPJ 與食鹽水進行之牙齒美白成效最好。
圖 2. 左邊為未處理前的牙齒照片，右邊為經各方式處理 20 分鐘後的牙齒照片，依序為 (a) 氦氣流；(b) H2O2 凝膠；(c) He-APPJ。
圖 3. 將三組經過不同處理後的平均美白強度 ΔE 量化結果。Δa 是紅綠度變化，Δb 是藍黃度變化，ΔL 是亮度變化，ΔE 為色差計算公式中的總顏色變化，為前三者的和方根。
將牙齒分別由上述三種方法處理 20 分鐘後，使用 SEM 放大 300 倍觀察牙齒表面以評估電漿與 H2O2 凝膠對於牙釉質的傷害程度。圖 4(a) 為對照組，表面沒有經過處理，圖 4(b) 是使用氦氣氣流搭配食鹽水的牙齒表面之 SEM 影像，無觀察到明顯的表面粗糙度變化，圖 4(c) 是使用市售美白凝膠的牙齒表面之 SEM 影像，觀察到非常明顯的表面變粗糙。圖 4(d) 為使用 He-APPJ 搭配食鹽水的牙齒表面之 SEM 影像，觀察到表面變粗糙程度比使用市售美白凝膠處理的牙齒表面平滑，因此使用 He-APPJ 與食鹽水進行牙齒美白後的牙齒琺瑯質所受之傷害明顯較小。可能原因是 He-APPJ 會使食鹽水產生 H2O2，因此造成牙齒表面些許粗糙。
圖 4. 牙齒經氦氣流、H2O2 凝膠、He-APPJ 處理 20 分鐘後，牙齒表面的 SEM 影像。(a) 為對照組；(b) 氦氣流搭配食鹽水；(c) 市售美白凝膠 H2O2 凝膠；(d) He-APPJ 搭配食鹽水。
量測活性氧物質 (reactive oxygen species, ROS) 的部分如圖 5 所示，在 309 nm 波長處量測到 •OH 放光訊號 (強度約為 250)，以及在 777 nm 波長處量測到 O 的放光訊號 (強度約為 200)，此結果說明了 He-APPJ 內的確有產生 ROS。•OH 應為牙齒美白之因素之一，後面我們也探討水溶液中之 H2O2 及 •OH 的關係。
圖 5. 電漿之光譜分析儀頻譜 optical emission spectrum (OES)。
•OH 的活性很強，最遲會在幾個毫秒 (ms) 內化合成 H2O2，如式 1 所示，因此並不容易量測，
我們使用對苯二甲酸 (terephthalic acid, TA) test 量測以 He-APPJ 處理後之食鹽水中 •OH之總量。如圖 6 所示，TA 和 •OH 反應會生成 2-羥基對苯二甲酸 (2-hydroxyterephthalic acid, HTA)，HTA 會受 310 nm 光激發而放出 425 nm 光，藉 425 nm 處放光強度搭配校正曲線換算 •OH 總量。隨著 He-APPJ 處理時間增加，進入食鹽水中的 •OH 總量也會增加，兩者間大致呈現線性關係。我們用自製的 He-APPJ 處理 100 mL 生理食鹽水 30 秒時量測到的 •OH 累積濃度約為 450 mM。我們也使用選擇性過氧化氫試劑 (amplex red assay) 搭配酵素免疫分析測讀儀 (ELISA reader) 量測以 He-APPJ 處理後之食鹽水中 H2O2 之濃度。在 He-APPJ 處理 0至 30 秒的時間內，隨著 He-APPJ 處理時間增加，食鹽水中的 H2O2 濃度也隨之增加，接近線性關係。30 秒時的 H2O2 濃度約為 50 mM。但在處理時間超過 40 秒後，H2O2 濃度增加幅度趨緩，這可能是因為當 H2O2 濃度達到一定程度時，溶液中的氯離子會開始和 H2O2 產生反應，而使得食鹽水中 H2O2 濃度增加率下降。實驗結果顯示使用 He-APPJ 處理 100 mL 的食鹽水 30 秒，能在食鹽水中分別產生 50 mM 的 H2O2 以及 450 mM 的 •OH。考量兩者反應關係與存在時間後我們推測，利用 He-APPJ 在食鹽水中所產生的 H2O2 與 •OH 兩者皆為造成牙齒美白之因素。
圖 6. (a) TA 和 •OH 反應生成螢光物質 HTA。當受到 310 nm 激發光時，HTA 會放出 425 nm 的螢光； (b) HTA 的量測系統，由 310 nm 光源和 425 nm 光譜儀組成。
四、低溫常壓電漿在水霧電漿輔助聚合用於快速蛋白質固定的應用
生物晶片發展已有數十年，生物晶片製程中能快速固定生物分子如蛋白質在晶片上，以利後續檢測與實驗的方法，一直是重要環節之一。生物晶片檢測的對象有 DNA 序列、胜肽 (peptide) 與蛋白質，製作的方法會因為對象而不同，像 DNA 與胜肽晶片可利用打點、光罩蝕刻、電化學等各種方法製作。固定蛋白質的傳統方法是先在晶片表面上生成官能基，再利用共價鍵將蛋白質固定在晶片表面，此方法的缺點是很耗時 (數小時)、要使用溶劑才能夠將蛋白質固定完成，步驟十分繁瑣。近期最新的研究顯示電漿可以替代上述方法，改用電漿輔助聚合沉積技術將生物分子固定在晶片表面，這項技術可用於藥物傳輸、食品表面抗菌膜與生物晶片製程等。其優點是官能基與鍵結生成所需之反應皆由電漿引發，故不需要使用化學藥劑且快速 (可於 5 分鐘內完成)。
筆者實驗室首先參考義大利巴里大學 (U Bari Aldo Moro) Favia 教授與陽明交大吳宗信教授合作發展之水霧電漿聚合沉積系統，並提高電漿聚合沉積塗層之附著效果(2)。大氣水霧輔助電漿沉積 (aerosol assisted atmospheric pressure plasma deposition, AAAPPD) 系統包含兩平板陶瓷介電質，介電質板上下兩端貼有鋁膠帶作為電極，如圖 7 所示。設定之工作電壓及頻率分別為 3 kV 與 4 kHz，作為工作氣體之氦氣之流量為 5 SLM，蛋白質水溶液藉由通過霧化器形成水霧狀，進入至電漿腔體內部前與乙烯 (ethylene) 混合，作為前驅物 (precursor)。電漿聚合過程中，乙烯透過電漿解離並重新聚合成電漿聚合乙烯 (plasma polymerized ethylene, PPE) 沉積於基材表面，水分子被電漿解離後在 PPE 表面生成成羥基官能基 (OH functional group)，此 OH 官能基會和蛋白質間形成氫鍵增加蛋白質與 PPE 間之吸附性，同時蛋白質也會包埋於 PPE 中，最後形成蛋白質—電漿聚合乙烯 (protein-plasma-polymerized ethylene, protein-PPE) 沉積塗層 (coating) 到基板表面。為了增強通過 AAAPPD 系統沉積的 protein-PPE 沉積塗層的附著性和聚合性，本實驗研究了電壓 (3 kV，4 kV)，陶瓷介電厚度 (1 mm，0.38 mm) 和預塗 PPE 層等方法的影響。
圖 7. (a) 大氣水霧輔助電漿沉積 (AAAPPD) 系統示意圖；(b) 電漿反應腔示意圖；與 (c) 電漿反應腔照片。
在 AAAPPD 實驗中，我們使用乙烯和脂肪酶—磷酸鹽緩衝溶液 (lipase-PBS) 水霧作為前驅物 (precursor) 同時聚合乙烯來包埋脂肪酶。用 SEM、傅立葉轉換紅外光譜 (Fourier-transform infrared spectroscopy, FTIR) 和表面輪廓儀 (urface profiler) 分析沉積的脂肪酶-PPE 塗層。如圖 8 所示，從 SEM 影像可看到當電壓提升和陶瓷介電質變薄時，表面 lipase-PPE 沉積增加。使用 FTIR 觀察則都可以看 O-H、N-H、C-Hx、C-O 等鍵結，由於 FTIR 不易做定量分析，因此只用來證明上述參數均能在表面沉積 lipase-PPE 塗層。
圖 8. 比較陶瓷介電平板厚度 (1 mm，0.38 mm) 和電壓 (3 kV，4 kV) 對於 lipase-PPE 沉積之差異，(a) SEM 影像；(b) FTIR 頻譜。
另外我們也在 lipase-PPE 沉積前先使用更高能量 (8 kV，10 kHz) 電漿沉積 PPE 預塗層(precoated buffer layer)，此預塗層之基材表面吸附力與穩定性強，且因都具有碳氫鏈故能提升 lipase-PPE 表面附著力。將塗層清洗後量測厚度評估塗層吸附力 (圖 9)，雖然 1 mm 介電質沉積之 lipase-PPE 塗層比較厚，但附著力差，因此在清洗後幾乎都被沖刷掉，反而是 0.38 mm 介電質沉積之塗層清洗後有殘留。而增加了預塗層後，兩種沉積在清洗後的厚度都提升許多，表示 lipase-PPE 附著力藉由預塗層改善了。
圖 9. 比較陶瓷介電平板厚度 (1 mm， 0.38 mm)、有無預塗層 (buffer layer) 和清洗前後之 lipase-PPE 沉積厚度。施加電壓 (3 kV， 4 kHz)。
我們的實驗結果顯示，將電壓提升 (從 3 kV 增加到 4 kV)，和將陶瓷電介質變薄 (厚度從 1 mm 減小到 0.38 mm)，可以改善塗層的附著力和聚合能力。另外，在 lipase-PPE 塗層之前以高能量沉積較穩固之 PPE 預塗層可增強附著力。
接下來我們進一步應用 AAAPPD 沉積法將蛋白質固定至晶片基材表面，應用於生物晶片製程(3)。優點是比傳統固定蛋白質方法更為快速，而且能避免使用化學藥劑。實驗中所使用之蛋白質為牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA)，由電漿聚合乙烯生成 PPE 後，BSA 嵌入至 PPE 薄膜內形成 BSA-PPE 沉積塗層。
研究主要分為五個步驟：第一步為分析沉積聚合 BSA-PPE 薄膜的特性，使用 FTIR 與 SEM 觀察薄膜之鍵結與薄膜聚合的清況 (如圖 10 所示)，確認 BSA-PPE 可順利聚合沉積。第二步驟是薄膜附著性分析，使用去離子水對 BSA-PPE 塗層進行沖洗，證明塗層於基材表面有足夠的穩定性。第三步驟是利用電泳、螢光免疫染色等方法驗證被固定於基材上之 BSA 活性，同時也量測電漿溫度低於攝氏 40 度，確認經過電漿反應後的 BSA 不會受到電漿影響而解離或變形，並保有活性。第四步驟為沉積 BSA-PPE 塗層於不同生物晶片基材上，證明 AAAPPD 系統可固定蛋白質於不同基材上。我們使用生物晶片常使用之聚二甲基矽氧烷 (polydimethylsiloxane, PDMS) 以及玻璃片此兩種材料和矽晶圓作為基材，於薄膜附著性與蛋白質活性上均有良好的結果。第五步驟為與傳統共價鍵固定法 (covalent binding) 做螢光免疫染色的比較，證明利用本系統沉積的 proten-PPE 塗層，其免疫染色與螢光強度效果和共價鍵法相近 (如圖 11 所示)。實驗結果證明利用 AAAPPD 系統固定蛋白質於生物晶片製程之可行性。我們提出的蛋白質 -PPE 塗層的改進技術使蛋白質於表面之附著更快速穩定，不需要藥劑，也可沉積於不同生物應用材料上，促進這種新的生物分子塗層固定技術的進一步應用。
圖 10. BSA-PPE塗層之 SEM 影像，(a) 正視圖；(b) 側視圖。
圖 11. 使用 AAAPPD 沉積蛋白質 (BSA) 和傳統共價鍵法固定蛋白質螢光免疫染色結果比較，使用生物晶片常用基板 (wafer、玻璃、PDMS)。
五、低溫常壓電漿在癌症治療的應用
癌症是人類死亡的主因之一，導致癌症的因子有很多，包括：基因遺傳、環境汙染、生活習慣…等等，這些因子誘發一連串的細胞不正常增生，最後誘發腫瘤。手術與放射性治療是常見且直接針對患部的治療方式但對人體傷害大。當腫瘤為惡性腫瘤時，通常需要全身化療來治療轉移擴散的癌細胞，此法用一種或多種細胞毒性藥物來干擾細胞分裂或引起細胞死亡，但會同時傷害正常細胞，對人體產生巨大耗損，因此為了減少化療藥物的副作用並提高患者生存率，需要提高癌細胞的藥物吸收效率。然而，近期許多研究顯示 (如普渡大學和名古屋大學)，低溫電漿具有殺死或抑制目標癌細胞而對鄰近正常細胞影響較小的特點。電漿也能夠增強細胞對藥物分子的吸收，這使電漿成為複合化療療法的良好候選佐劑，加上其可攜性、成分可調節、人體傷害小、氣態故不受表面張力限制容易進入狹小孔洞等優點，使電漿成為癌症治療的新可能。
為了對電漿的癌治療機制有更深入了解，筆者實驗室首先分析電漿已處理溶液中的高活性氧物質 (ROS)(4)。本研究系統地分析了氦氣低溫大氣壓電漿束 (He-APPJ) 於氣相、氣液介面、液相中產生的 ROS。ROS 對於細胞和生物體的影響十分重要，是生物體進行有氧代謝過程中必定會產生的多種離子的副產品，其中包括含氧自由基，在外在環境的影響下，也會導致 ROS 的量增多，疑似與細胞結構遭到損害有關，此稱為氧化應激 (oxidative stress)。
ROS 中，氫氧自由基 (•OH) 和過氧化氫 (H2O2) 是重要成分。我們通過光譜分析儀 (optical emission spectroscopy, OES) 分析了 He-APPJ 中氣相和電漿處理溶液表面的 •OH 放光 (309 nm)，分別使用前述 TA - test 和 Amplex red 測定了電漿處理溶液中的 •OH 和 H2O2 濃度。如圖 12 所示，處理時間越久進入溶液的 •OH 總量越多。由於 •OH 和 H2O2 均會和溶液中的物質反應，因此純水中之 •OH 和 H2O2 濃度最高。一般而言溶液成分越複雜，•OH 和 H2O2 之濃度與生成率會越低，所以可以看到磷酸緩衝溶液 (phosphate buffered saline, PBS) 和細胞培養液 (Dulbecco's modified minimal essential medium, DMEM) 中的 •OH 和 H2O2 較低。此外由於 DMEM 中的蛋白所放螢光和 HTA 波長相近，因此無法進行 •OH 量測。我們也觀察到有較高導電率的溶液可能會導致溶液表面較強的 •OH 放光，原因可能來自於表面電荷累積。
圖 12. (a) 使用 CCD 攝影機拍攝電漿處理溶液不同時間之 HTA 放光。電漿處理後不同溶液中 (b) •OH and (c) H2O2 濃度。Data are mean and SD values (n = 3)。
我們也討論了在 He 工作氣體中添加 O2 對 •OH 和 H2O2 生成的影響。如圖 13 所示，在電漿的工作氣體 He 中添加 0.1% 的 O2 會產生最強的 •OH (309 nm 處) 放光強度。電漿處理過的溶液中，也以添加 0.1% 的 O2 產生的 H2O2 濃度最高。這是因為添加少量 O2 能夠增加
•OH 生成，但當 O2 更多時，O2 會和電子反應而使電漿強度降低。
圖 13. (a) 在不同濃度 O2 添加下 He-APPJ 的 309 nm 放光強度。(b) 不同濃度 O2 添加下，He-APPJ 處理的純水中 H2O2 濃度。
在分析電漿的 ROS 生成後，筆者實驗室討論電漿處理溶液 (plasma treated medium, PTM 或稱 plasma activated medium, PAM) 應用於肋間膜癌等癌症的治療效果(5)。肺癌合併肋膜轉移過去被視為後期疾病，無法接受開刀根治，只得選擇化學藥物或標靶藥物治療，存活率遠低於早期疾病。轉移之腫瘤細胞常造成轉移處局部病變，肋膜轉移常造成肋膜腔積水，壓迫正常肺組織，致使患者產生呼吸症狀。傳統上肋膜腔病變以緩和治療為主，根據患者之症狀給予肋膜積水引流等療法，無助於治癒此疾病。近年來新的醫療技術如光動力療法 (photodynamic therapy) 及熱化學肋膜腔灌注治療 (hyperthermochemotherapy) 對肋膜腔腫瘤之控制及患者存活率有一定的提升，但對其附近之正常組織仍有一定的影響及全身的副作用。低溫常壓電漿束 (APPJ) 可望解決此問題，研究顯示電漿產生之 ROS 具有可影響癌細胞內外基質，造成癌細胞萎縮，抑制癌細胞修復機制，引發癌細胞自然凋亡等功能。且電漿生成之 ROS 存在時間短，相較於化療、放療等治療方法，對人體傷害更小。
本研究評估電漿處理之培養基 (PAM) 並比較熱化學肋膜腔灌注治療對於癌細胞和正常細胞之影響。使用 APPJ 處理細胞培養基產生含有各種 ROS 之 PAM，再用此 PAM 處理預先分離培養的肺癌細胞及間皮細胞樣本，實驗架構如圖 14 所示。
圖 14. APPJ 處理培養基生成 PAM (a) 示意圖與 (b) 電漿處理 96 孔盤中培養基照片。
為了穩定控制 PAM 中的 RONS 劑量，我們混合 120 秒電漿處理的 PAM 與新鮮 RPMI 細胞培養基溶液，避免電漿生成 RONS 濃度變化問題，量測 PAM-RPMI 混合液確認 H2O2 與硝酸鹽與混合比例呈線性相關。
我們用 PAM-RPMI 混合液處理肺癌細胞 (CL1-5) 和良性間皮細胞 (benign mesothelial cell) 2 小時，結果如圖 15 所示，隨著 PAM 劑量增加肺癌細胞的活性明顯下降，而良性間皮細胞的活性受到影響不大。細胞的外觀上，PAM 處理後的肺癌細胞數量明顯減少且縮小，但良性間皮細胞變化不大。我們也使用 Annexin V 和 PI 進行流式細胞儀分析，確認 PAM 處理後肺癌細胞凋亡和死亡數量明顯增加而良性間皮細胞變化小。我們分析細胞的數量與遷移率，也得到類似的結果，肺癌細胞被明顯抑制而良性間皮細胞影響不大。因此，我們發現 PAM 會抑制肺癌細胞 (CL1-5) 的各種表現並促進其凋亡，但對良性間皮細胞各方面的影響都不大。
圖 15. CL1-5 肺癌細胞和良性間皮細胞以 37 °C 不同比例的 PAM-RPMI 混合液處理兩個小時，並在一天後量測 (a) MTT 活性和 (b) 外觀。Data are mean and SD values (n ≥ 3)。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 (Student’s t-test)。
除了 CL1-5 肺癌細胞與良性間皮細胞，我們也用 PAM 處理了其他種類的細胞株，並用細胞存活率分析 (MTT assay) 量測其活性，結果發現，使用 PAM 處理後，CL1-5 與 A549 肺癌細胞受的活性都下降比較多，而良性間皮細胞、纖維細胞 (normal fibroblasts) 和癌相關纖維細胞 (cancer-associated fibroblasts) 活性影響都不大 (圖 16)。
圖 16. 不同細胞株在 37 °C PAM 處理兩小時後，經過一天之 MTT 活性。Data are mean and SD values (n = 3)。
我們也比較 PAM 治療和熱灌注搭配順鉑 (cisplatin) 藥物療法 (hyperthermochemotherapy)，
結果如圖 17。熱灌注可有效殺死 CL1-5 細胞，但也嚴重傷害良性間皮細胞，這可能是熱灌注化學療法引起的副作用的徵兆。相比之下，PAM 治療的良性間皮細胞的活性明顯高於熱灌注化學療法，表示 PAM 治療比高溫化學療法副作用更小。
圖 17. 將 CL1-5 和良性間皮細胞用 43 °C 食鹽水搭配 cisplatin 處理或用 37 °C 的 PAM 處理 2 小時。然後進行 MTT 分析細胞活性。Data are mean and SD values (n = 3)。*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001 (Student’s t-test)
此外熱灌注化學療法的臨床過程通常需要 2 個小時，這可能給患者帶來很大負擔。因此，我們也嘗試以更高劑量 PAM 來減少治療時間的可能性。實驗結果顯示，用電漿處理 4 分鐘和 6 分鐘所生成的 PAM 來培養細胞 90 分鐘其細胞抑制效果，與電漿處理 2 分鐘後所生成的 PAM 來培養細胞 120 分鐘的細胞抑制效果相近。這表示可以通過增加電漿處理 PAM 時間來減少治療時間。
我們也在另一個研究中討論電漿增加細胞膜通透性進而提升癌症化療藥物治療效果的可能性(6)，此作用可以降低化療藥物使用的劑量。我們發現使用 PAM 作為培養基可導致 DiI 螢光染料更有效地進入細胞，如圖 18 所示。這表示類似於 DiI 分子大小的抗癌藥物也可以藉由 PAM 輔助提高進入細胞數量和毒殺細胞的效果。我們把 PAM 與抗癌藥阿黴素 (Doxo) 結合治療人肝細胞癌 HepG2 細胞和人類非小細胞肺癌 A549 細胞。結果表明，與單獨使用 PAM 或 Doxo 處理相比，PAM 和 Doxo 聯合處理對癌細胞的殺傷力更高。驗證了 PAM 與其他藥物聯合使用具有改善治療癌症的潛力。
圖 18. 經由 PAM 處理後，進入細胞的 DiI 螢光染劑數量增加。
綜上所述，電漿處理後之肺癌細胞及間皮細胞經由活性、細胞數、自然凋亡等各種測試證實，電漿對肺癌細胞之抑制高於對間皮細胞與纖維細胞等正常細胞。電漿也可提高藥物進入細胞膜的數量。研究成果可望改變現今之肺癌合併肋膜轉移等癌症療程，發展出對於癌症病人傷害小卻有療效之嶄新電漿生醫應用。