簡介漫反射光譜學－光學穿戴式生理監控裝置之核心技術
Introduction of Diffuse Reflectance Spectroscopy-the Core Technology for Optical Wearable Physiological Monitoring Devices
漫反射光譜學近年在生醫光學領域得到廣泛的應用。基於適當的理論模型，漫反射光譜系統可快速地將量測訊號轉譯成為人體生理參數量測。除了可用於動脈血氧比例量測，也是許多團隊用於開發光學穿戴式量測血糖、血壓設備的核心基礎。本文將會介紹漫反射光譜學技術的量測原理，並分享皮膚膠原蛋白、新生兒膽紅素與血紅素等臨床應用結果。
Diffuse reflectance spectroscopy (DRS) has been widely used in the field of biomedical optics in recent years. Based on proper theoretical models, DRS not only can be used in quantifying arterial oxygen saturation level, but also used by many groups for developing wearable devices for blood glucose and blood pressure monitoring. In this article, we will introduce the theoretical background of DRS and show its clinical applications in investigating skin collagen concentration, and quantifying neonatal bilirubin and hemoglobin levels.
一、漫反射光譜學理論
生醫光學 (Biomedical Optics or Biophotonics) 是利用光電科技偵測與量化生理參數的一門科學，而其中漫反射光譜學 (diffuse reflectance spectroscopy, DRS) 技術，其無創 (noninvasive)、即時且可連續監控生理參數的特性，讓相關醫療技術不斷研究開發(1-3)。利用擴散理論 (diffusion theory)，可將漫反射光訊號換算成組織的光學參數 (吸收係數 absorption (ma)、散射係數 scattering (ms))，並藉由所獲得的吸收、散射光譜再進一步推算出欲獲得之生理參數，如細胞的平均大小、血紅素、黑色素與水分等濃度，達到量化組織成份的目的(4)。此技術也是目前非常熱門的光學穿戴式血糖、血壓量測的核心基礎。
1. 漫反射光譜學分類
目前 DRS 主要可以分為空間解析漫反射光譜法 (spatially resolved diffuse reflectance spectroscopy, SRDRS)、時域解析漫反射光譜法 (time resolved diffuse reflectance spectroscopy, TRDRS) 與頻域解析漫反射光譜法 (frequency domain photon migration diffuse reflectance spectroscopy, FDPM-DRS)，計算吸收和散射係數有主要三種不同的光源型態，其形式表示於圖 1：
圖 1. 漫反射光譜技術三種主要不同類型的光源 (a) 空間解析：以一固定光強度入射組織 (b) 時域解析：以一脈衝光入射組織 (c) 頻域解析：正弦頻率調變光入射組織。
空間解析漫反射光譜法，通常使用寬波長 (600－1100 nm) 穩態光 (steady state, SS) 光源，光以連續波偵測組織(5-9)。SS 系統需要至少兩個以上光源至偵測器 (source-detector, S-D)的距離量測，被稱為空間解析，透過反射光強度在不同 S-D 距離下的比例來決定吸收係數和縮減散射係數。
時域解析漫反射光譜法，光以脈衝形式入射組織(10, 11)，進入組織後因組織中吸收和散射現象，脈衝光衰減，並隨著時間變化。時域解析漫反射光譜法可以使用單一光源至偵測器 (S-D) 的距離量測來決定吸收係數和縮減散射係數。
頻域解析漫反射光譜法，透過調變光源強度成隨時間頻率變化的正弦波(12-18)，偵測光在組織中傳播時被衰減的光強度振幅和相位延遲用以計算吸收係數和縮減散射係數。當光源以多頻調變，振幅和相位延遲的量測值只需要一個 S-D 的距離就可以解出吸收及縮減散射係數。
三種漫反射光譜法，又以 SRDRS 最符合臨床應用，其儀器架構相對低廉，資料擷取速度快，具有商品化的優勢。傳統 SRDRS 主要藉由一固定的偵測端，搭配不同偵測距離 (source detector separations, SDS) 的光源，將光源打入待測組織上，收取光源經組織不同距離下的漫反射光譜，以擴散理論的近似模型 (diffuse approximation) 簡化後的輻射傳播理論，先算出待測組織的 ma 與 ms。再以吸收係數的變化配合 Beer-Lambert’s Law 求出樣本的成分比例。
2. 擴散理論 (Diffusion Theory)
擴散方程式 (diffusion equation) 常被使用於計算生物組織的光學參數，也就是吸收與散射係數。傳統擴散近似方程式，光子在組織中的行走路徑必須夠長，也就是量測的樣本散射係數必須遠大於吸收係數，量測的結果才具有準確性。我們會藉由輻射傳播方程式 (radiative transfer equation, RTE) 來推導擴散方程式 (diffusion equation)。利用輻射傳播方程式的數學模型，可計算出光在生物組織中的傳遞情形的各項參數的解析解數值(19)。
考慮一微小柱狀區域，如圖 2 所示，ds 是一微小長度並沿著
方向， dA 為一微小面積並垂直於方向。接著我們考慮在這柱狀體積中，環繞著方向的微小立體角 dW 產生的能量變化，以及環繞著
方向的微小立體角 dW′ 產生的能量變化。能量變化的方式有能量的散度、損耗、散射以及光源四種方式，並透過能量守恆的概念可得到在微小柱狀體積下能量的變化 dP。
圖 2. 微小的柱狀體積(19)。
而輻射傳播方程式中的輻射值 L(
,,t) (Wm-2sr-1) 被定義為單位面積、單位時間、頻率在 [ν, ν + Dν] 範圍下通過之能量。光流通率 Φ(, t) 則寫為
光擴散通量 J 被定義為單位面積、單位時間能量淨流量，並寫為
如果傳播的光子束為非準直的話，輻射值 L(,,t) 的散度值不為零，所以考慮能量的散度變化 dPdiv
考慮在微小柱狀體積內因為吸收或散射造成的能量損耗 dPext，
式中 mtds 表示因為吸收或散射造成能量損耗的機率。考慮由任意方向能量散射至沿著方向且環繞 dW 中的能量產生的變化 dPsca，
由於 ms = Ns ss ，所以可得
考慮光源造成的能量變化 dPsrc，
式中 S 的單位為 W/(m3 sr)。
考慮在微小 (,,t) 柱狀體積下能量的變化 dP，
綜合以上各式可得到輻射傳播方程式 (RTE)
由於 RTE 有 6 個變數 (x, y, z, θ, φ, t) 難以求解，所以通常會藉由擴散近似將 RTE 簡化。擴散近似假設光在組織中的散射狀態接近於等向散射，因此可利用球諧函數 (spherical harmonics) Yn,m 對擴散輻射值 L(,,t) 做近似展開
上式中 Ln,m 代表膨脹係數，n = 0，m = 0 代表等向散射，n = 0，m = ±1 代表非等向散射，而球諧函數 Yn,m 可由 Legendre 多項式展開 Pn,m 得到(19)
式中的
將公式 (12) 代入公式 (2) 中，我們可以得到
移項後得
上式中單位向量為
將單位向量乘上公式 (12) 並帶入公式 (13) 中，我們可以得到
移項後得
綜合以上二式，我們可以得到經擴散近似後的輻射值 L(,,t)
若將公式 (20) 的輻射值 L(,,t) 代入公式 (11) 的輻射傳播方程式 (RTE)，並且積分 4p 的立體角，可得到純量微分方程式
若將公式 (20) 的輻射值 L(,,t) 代入公式 (11) 的輻射傳播方程式 (RTE) ，再乘上後積分 4p 的立體角可得到向量微分方程式
此外為了將微分方程簡化為只有 Φ(, t) 的變數，所以我們假設當 lt′ 很小時
(, t) 的變化相當小，也就是
移項後可得
根據以上的條件，公式 (22) 中時變的項次可忽略，所以簡化為
此為 Fick’s law，上式中的 D 為
將公式 (25) 的 Fick’s law 代入 公式 (20) 的輻射值 L(,,t) 可得到
將公式 (23) 的 Fick’s law 代入 公式 (21)，便可得到擴散方程式 (diffusion equation)
簡言之，從 RTE 推導至擴散方程式 (diffusion equation) 有兩個近似的假設，第一個是將 RTE 輻射值 L(,,t) 由球諧函數 Yn,m 展開並近似至第一項次，第二個是假設當 lt′ 很小時(, t) 的變化相當小。為了滿足以上兩條件，光子進入介質後的散射次數必須足夠多次，因此將兩個近似簡化並看作為 ma << ms′，此外光源離邊界的距離也必需夠遠，如果可以考慮邊界條件，即可增加其精確性，故下面將繼續推導邊界條件。
3. 邊界條件
由於非侵入式的量測，是將偵測端以及光源端平貼於待測組織上，並非在無窮大的邊界裡，所以需要考慮邊界條件，如圖 3，為半無窮大的假設，這樣的假設能使擴散理論增加精確性。
圖 3. 無窮大邊界 (a) 與半無窮大邊界 (b) 示意圖。
如果邊界兩端介質折射率為相同，即光在邊界上不會產生反射，因此邊界上的輻射值為
如果邊界兩端介質折射率不同，即光在邊界上會產生反射，因此邊界上的輻射值可表示為
我們假設光的 RFresnel 是非偏振光，所以 RFresnel 可寫成
上式 θ 為入射角，θ′ 為折射角。在公式 (30) 中左式的輻射值可寫為
在公式 (30) 中，右式的輻射值可寫為
上式的 Rφ 及 RJ 為
綜合以上式子，邊界條件
此外在擴散的機制中，我們定義了有效反射係數，
以及根據擴散近似得到的 Fick’s law
邊界條件可寫為
或者
上式的 CR 可表示為
將公式 (39) 用泰勒展開式展開至第一階，我們可以得到，
由上式知當
= -2CRD 時，通量 Φ = 0，亦即實際的邊界 (extrapolated boundary) 應修正為 
= -2CRD ，如圖 4 所示。
圖 4. 光源假設與邊界位置。
對於大部分的生理組織，光學性質具有低吸收高散射的特性，故入射光在組織中經過 z0 = 1∕(ma + ms′) 的傳播距離後會成為等向散射。因此可將垂直入射的光束近似成在 z = z0 = 1∕(ma + ms′) 的位置為一正的點光源，以及在對稱於邊界 z = zb = -2CR D 的位置，也就是 z = -z0 - 2zb 的位置為一負的點光源。而通量 Φ 的解可寫為
上式中，
最後，我們可將反射光強度由下式表示 (θ 為入射角角度)。
二、適用於淺層組織漫反射光譜技術
如先前所提，傳統的漫反射光譜技術是使用光子擴散理論，配合最小平方誤差法，計算組織的吸收與散射特性。但因為擴散理論中的相位函數與能量分布的近似處理，所以只能在光源與光偵測器距離 (SDS) 較長，以及吸收遠小於散射的條件下使用。因此光子擴散理論無法適用於 SDS 小於 3 mm 的量測，以及待測物屬於高吸收或低散射的情況，下面將介紹一種可適用於量測淺層組織的光子遷移模型 (Modified two-layer, MTL)。
Modified two-layer (MTL) 光學模型，又稱為調整雙層式光學架構，是將光源端出光口前加入一片高散射且低吸收的散射片，而偵測端則是直接穿出散射片，藉此讓光被接收前有獲得充分的散射，不僅可有效的滿足擴散理論的近似假設，也能接受到來自淺層組織的光訊號，有效定義出其光學特性，MTL光學模型如下圖 5 所示。
圖 5. MTL光學模型架構圖。
MTL 擴散模型是由 Kienle et al. 提出的雙層擴散模型(20) 延伸出來的，其擴散方程式可寫為
此處的
和 Φi 是第 i 層的擴散常數和通量。
利用二維傅立葉轉換可將通量 Φ 寫為，
其中 
。由上式，公式 (47) 可寫為
此處的 ai2 = (Dis2 + mai)/Di 並且 s2 = s12 + s22
由以下的邊界條件可解公式 (49)
此處
，並且在公式 (52) 中，且假設第一層與第二層的折射率相同，此時通量
ϕ1 (z, s) 的結果為
已知 l ≥ l0，故可以得到
然後使用二維的傅立葉反轉換可得通量 Φ
上式的 
而 J0 是第零階的貝索函數 (Bessel function)。最後將第二層的半無窮大區域的輻射 (radiance) L2 積分，可得光強度 R(ρ) 值，
三、色團濃度定量
1. 比爾定律
物質的吸收能力取決於等效的吸收截面積 σa，等效的吸收截面積即為吸收效率 Qa 與物質垂直於光入射的最大截面積 a 之乘積。
吸收係數 μa 為單位體積下，吸收物質的個數 Na 與 σa 的乘積。
光子被吸收前的平均有效路徑 la 即為吸收係數 μa 的倒數，由此可知，當有效路徑越長時，吸收係數越小。
比爾定律又稱為比爾朗伯定律，僅適用於稀釋溶液，因當溶液濃度太大時，分子間的相互作用力則無法被忽略，且此溶液必須為不具備散射特性的純吸收溶液，否則也不適用於比爾定律。
一束平行光強度為 I0 垂直通過一均勻且非散射的吸收溶液時，如圖 6，因溶液對光的吸收，使入射光強度降為 I，已知溶液對於光的吸收能力與其與光的截面積大小成正比。假設光通過一邊長為 b 的比色皿，我們可以將垂直於入射光的方向上分成多個無限小厚度 db 的薄片，因此光的衰減可以下式表示：
此時將公式 (60) 兩邊同時積分，可得：
因此吸光度 A，可以換算成：
C 為吸收溶液的莫耳濃度，公式 (63) 可以簡化成：
其中 
吸收係數因此可簡化成：
圖 6. 光束通過溶液示意圖。
2. 色團擬合
光子在人體組織中傳遞時，會受到組織中各種不同的吸收物質以及散射物質影響，導致漫反射的現象產生，這些吸收物質統稱其為發色團 (chromophore)，人體組織中有多種色團，各色團有其相對應不同特徵的吸收光譜，因此可以將量測所得到的組織光譜，與已知發色團的光譜做光譜擬合，藉此得到各色團在組織中的成分比例。
例如量測皮膚組織的光譜，經由反向擴散方程式，將皮膚的漫反射光譜轉換成吸收光譜以及散射光譜，此時的散射光譜已經被獨立出來，因此可將組織的吸收光譜視為不含散射之純吸收光譜，因此可以套用於比爾定律中。為了算出皮膚組織中的發色團濃度，可藉由 MATLAB® (MathWorks®，MA，USA) 中內建的「lsqcurvefit」非線性曲線擬合函數，利用最小平方誤差法的概念，去擬合皮膚組織之吸收光譜 μa(skin) 中的色團濃度(3)。人體皮膚於 500－1000 nm 常見的吸收物質為：帶氧以及不帶氧血紅素、黑色素、脂質、膠原蛋白和水分，其吸收光譜如圖 7 所示。
圖 7. 人體皮膚組織主要的吸收物質。
四、應用於淺層組織量測的穩態光漫反射光譜學系統
本實驗室所架設的系統儀器包含客製化探頭 (MTL probe，孔徑：400 mm，NA：0.22，多模光纖，高散射平板)、氙燈閃光光源 (xenon flash light L11946，Hamamatsu)、光譜儀 (QE65000，Ocean Optics) 以及光纖跳接器 (optical switch，Piezosystem Jena，Germany)。系統架構如圖 8 所示，其中在光源端會加上高通濾光片 (FEL0400，Thorlabs)，以確保照射到人體的光不含 UV 波段，並將光耦合進光纖跳接器，再利用跳接器與探頭做連接。探頭設計如圖 8 中虛線框所示，一根偵測光纖與四根光源光纖，四根光源光纖都貼齊在厚度 1 mm 的高散射平板上，偵測光纖與最近的光源光纖中心間距為 1.4 mm，其他三根光源光纖都緊貼著第一根，而五根光纖為一直線排列，最後再將偵測端光纖連接至光譜儀。圖 9 為臨床量測使用之箱型系統。
圖 8. 平台式漫反射光譜系統架構圖。
圖 9. 穩態光漫反射光譜系統實際裝箱圖。
五、皮膚生理組織臨床應用
光學的量測方法，可快速且非侵入式的獲得人體生理參數，藉此應用在臨床的評估與診斷。初步的臨床皮膚檢測上除了問診，主要還可分為視診與觸診，如此的診斷方法除了需具備相當充足的醫學知識外，還需要臨床經驗的累積，才能將主觀的感受轉換成正確的判斷，例如膚色以及患部軟硬度的變化與差異等，可經由量化對應到何種病理與生理現象。組織切片的檢測方式雖然可獲得豐富且完整的資訊，但通常需要耗時三到七天的等待時間，無法快速判斷皮膚患部的狀態，此外，造成開創性的傷口也是病患為之卻步的主要因素。因此以非侵入、準確且即時地提供醫師或其他醫療美容從業人員實用的資訊，讓醫師與患者皆能以更客觀、快速的方式了解膚況，對臨床診斷與醫病關係將有極大的幫助。
1. 膠原蛋白與蟹足腫疤痕之相關性研究
皮膚結構包含表皮層、真皮層與皮下組織。膠原蛋白主要位於真皮層內，提供皮膚彈性與支撐的功能。迄今，臨床上尚未有客觀評估與量化皮膚內膠原蛋白的方法。我們希望以光學偵測的方式研發非侵入式且快速量化皮膚內膠原蛋白含量的方法(21)，以提供臨床醫師快速、方便且客觀的檢測儀器。而蟹足腫疤痕就是膠原蛋白不正常增生的疾病。
運用自行架設的穩態光 DRS 系統與成大醫院的皮膚科醫師合作，收集了 71 位患者共計 228 筆蟹足腫疤痕的光譜資訊，進一步做色團擬合的分析，發現的確可以使用 DRS 系統測量到的膠原蛋白含量作為蟹足腫嚴重程度的區分 (如圖 10)，還可以運用疤痕內的組織血氧與水分的變化來評估蟹足腫治療效果的好壞 (如圖 11)，這些都是以往臨床診治上難以觀察並量化的現象。詳細研究成果請見發表的期刊論文Journal of biomedical optics 17 (7), 077005 與 Biomedical optics express 6 (2), 390-404。
圖 10. 蟹足腫嚴重程度與膠原蛋白含量比例之關係(3)，圖 (a) 中的 P 和 V 分別為平行疤痕的量測與垂直疤痕的量測)。
圖 11. 蟹足腫治療程度與膠原蛋白、組織血氧與水含量比例之關係(3)，圖 (b)、(c)、(d) 中的 P 和 V 分別為平行疤痕的量測與垂直疤痕的量測)。
2. 新生兒黃疸
新生兒黃疸好發於出生一至二週的新生兒，在亞洲有高達六成以上的比例，新生兒黃疸所致之核黃疸，更是開發中國家新生兒死亡的原因之一。目前臨床上仍需倚靠抽血為檢驗標準，而抽血檢驗除了造成新生兒疼痛，在一些沒有完善抽血檢驗設備的地區或是國家，更有感染風險及醫療廢棄物處理問題，因此經皮量測黃疸儀有其實質的醫學價值，國際上有不少團隊持續在這議題上進行開發研究(22, 23)。
本實驗室運用自行架設的平台式 DRS 系統與高雄榮民總醫院的小兒科合作，總共量取 35 名足月 (大於 36 周) 且出生大於 2000 公克之新生兒，利用 DRS 系統量測額頭與胸口兩個位置，量測結果與腳跟採血所獲得的總血清膽紅素值 (total serum bilirubin) 做相關性比較，如圖 12 所示，額頭的相關係數為 0.85，而胸口的相關係數高達 0.95，可量測範圍為 1.2－19.8 mg/dL，由此結果可知，漫反射光譜學系統，可為非侵入式的新生兒黃疸診斷工具。詳細研究成果可參閱已發表之論文 Biomedical optics express 10.6 (2019)(22)。
圖 12. 自行架構之 DRS 系統所量測的經皮膽紅素數值與總血清膽紅素之相關性分析 (a) 額頭測量 (b) 胸口測量。
3. 新生兒貧血
貧血是一種常見疾病，根據 WHO 的資料，全球 5 歲以下孩童患有貧血的比例為 41.7%，兒童貧血會影響行為、記憶、學習和感覺系統，多份研究報告指出，貧血兒童的運動和智能發展指數較正常兒童低很多。兒童患有貧血的風險很高，造成的神經發育傷害後復原困難，對學習以及成年後的發展都有著重大和深遠的影響。現行貧血診斷方法仍為抽血，但血液常規檢查並不在每年兒童健康檢查項目中，因此貧血問題容易被忽略，若無法及時診斷治療，長期的慢性貧血更可能造成其他器官病變，此外，兒童抽血困難，不僅需要專業的檢驗人員以及設備，又因為嬰幼兒血管較細與無法配合等因素，經常造成醫護人員壓力，因此非侵入式的快速檢測裝置有其必要。
運用自行架設的穩態光漫反射系統對新生兒的額頭、胸口與手臂等三個位置進行血紅素 (hemoglobin, Hb) 測量，與新生兒腳跟採血所獲得的血比容 (hematocrit, Hct) 做間接比對，實驗結果如圖 13 所示，於額頭、胸口與手臂的相關係數分別為 0.76，0.94 與 0.86，該實驗目前持續進行中，受測者數量仍須增加，雖不是直接比對新生兒的血紅素數值，但初步結果仍可看出血紅素趨勢。團隊並將此量測系統進行穿戴式裝置的小型化開發，以便於需要長時間監控的場域使用，如此可預見 DRS 系統能有相當多元的臨床應用。
圖 13. 自行架構之 DRS 系統於新生兒所量測的經皮血紅素濃度與腳跟血所獲得的血比容數值之相關性分析 (a) 額頭 (b) 胸口 (c) 手臂
六、結論
穩態光漫反射光譜學技術屬於架構成本相對低廉，並可快速獲得各項人體生理參數等豐富資訊的一項技術。建置一套穩態光空間解析的漫反射光譜學系統原理上並不困難，只要有兩組以上的 SDS 就能以最小平方誤差法疊代出該光源波長的吸收與散射係數，如果有足夠多組發色團特徵波長的吸收係數，就能進一步擬合出各個發色團的濃度比例。由以上的討論可知，穩態光漫反射光譜技術的光學架構非常適合開發穿戴式裝置，配合適當的演算法，達成各種重要的人體生理參數連續監控。
然而，實際應用上卻有許多需要進一步考量的因素，如何選用合適的光源與光偵測器的組合以獲取目標生理參數？如何消除系統響應所造成的光強變化與理論的誤差？如何避免環境光所造成的影響？如何選定量測部位與其臨床意義？這些都是應用漫反射光譜系統於實際檢測上會面臨到的問題。本實驗室的研究團隊對系統架設與量測手法，積累相當豐富的實作經驗，並持續克服了上述種種實質上的困難，完成上述臨床研究結果。本文對漫反射光譜學的初步介紹，謹供各位先進參考，並歡迎來信討論與交流。
