簡介生物檢體細胞之完整蛋白分子質譜技術
Introduction of the Biological Intact Protein Analysis by Mass Spectrometry
隨著蛋白體學成熟還有精準醫學進展，近年來在臨床檢測上針對疾病相關的蛋白質診斷需求也越來越多。傳統上利用蛋白質生化電泳的檢測方式，操作時間長且解析度較低，若選擇抗體抗原結合的檢測方式針對標的蛋白分析，亦有檢測抗體成本高的問題。質譜儀提供質荷比的分析資訊，近年來質譜儀也蓬勃應用於大分子質譜的檢測，本文亦將討論質譜相關技術，涵蓋儀器設計以及質量分析器中帶電粒子的運動情形，從物理學角度帶領讀者深入討論質譜技術的發展，並從現有大分子質譜分析方式，說明其中所涉及的技術與偵測極限。生物質譜檢體種類多元，包含臨床檢體、微生物樣本以及食品藥物等，整體生物質譜檢測質量範圍寬。然而，由於生物樣本在結構上複雜不易游離，使得蛋白質這類大質量分子仍有檢測上困難。目前在蛋白質質譜量測上可以分成兩種手段，一種是直接量測完整蛋白質，而另外一種則是將大分子蛋白質進行水解後再進行質譜分析。本篇研究將利用基質輔助雷射脫附游離法結合新型離子阱質譜儀，說明如何處理生物樣本，並在質譜儀上機後透過訊號後處理方式，提供了一種針對大分子完整蛋白的質譜量測方式。
With the development of proteomics and precision medicine, it is increasingly using protein targets for disease diagnosis and prediction. Two often-in-use methods are electrophoresis, which is time-consuming and with lower accuracy, and conjugation of antigen and antibody, which can identify specific proteins, yet, is a bit expensive for each detection. Alternatively, a mass spectrometer (MS) can provide the information of mass to charge ratio (m/z), such that recent MS techniques have been accordingly applied in clinical, microbes, food safety, and drug development. Here, we will introduce a MS method for the detection of large, and intact biological molecules. Over the variety of mass spectrometers, we will discuss all its instrumentation via the motion of in-trap charged particles. Usually, it is not easy to ionize the intact protein, for its large mass and complicated structure. Thus, protein research indirectly uses enzyme digestion to cut protein into peptide pieces for traditional MS analysis. Here, for the direct detection of intact proteins, the method of matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) is tactically arranged nearby the inside of the ion trap. Together with one innovative charge detector, phase-modulated spectrometry can be introduced for intact molecular ion analysis.
一、質譜技術於健康醫療的應用與展望
醫療進展至今，個體醫學、以至精準醫療 (precision medicine) 逐漸被重視。相對於一般醫療過程中，以臨床診斷的「嘗試與錯誤」，即醫師人員專業經驗及醫學指南判斷，來減輕病症、降低副作用的方法；現代醫療更進一步、利用個人基因表現及臨床資料資訊，選擇最適合個人使用之藥物、治療方法、或預防方式，以期達到藥品最大療效與最小副作用。
現代醫學，則嘗試從體學因子角度 (omics factors)，討論基因體、轉錄體、蛋白體、直至代謝體，包含了對一般生活型態的足跡追蹤。對已掌握後續確認診斷方法，或有效治療方法的陽性個案，去尋找其生理代謝、癌症疾病、或藥物治療等過程中的生物標記 (biomarker)。
圖 1. 現代精準醫學中質譜儀介入角色(1)。
例如，現行中央主管機關 (我國衛福部) 認定之 21 項新生兒先天性代謝異常疾病，會運用現有「串聯質譜儀 (tandem mass spectrometry)」技術，來作早期篩檢、有效掌握部分胺基酸、脂肪酸代謝異常、及有機酸血症等多種疾病。又如，從侵入性黴菌感染、超級抗藥性細菌等相關的血液感染，到新型冠狀病毒感染，皆有對應的生物標記分子，由「飛行時間質譜儀 (time-of-flight mass spectrometry, TOFMS)」技術，搭配生物分子其合適的製備及游離方法，來嘗試全面地累積檢體的體學因子資料庫、進行生物統計，逐步地提供充分的健康醫療資訊 (表 1)。
表 1. 各國官方組織中公告利用質譜儀找尋生物標的及檢測方式(1)。
2000 年後，質譜技術的應用延伸至生物檢測，其來源涵蓋標準細胞株、臨床檢體、微生物樣本、環境採樣、食品抽查等。檢測項目除了生物內核酸、蛋白質及代謝產物，也跨足到藥物檢測領域；質量範圍寬廣、種類多元，搭配的樣品前處理多樣且複雜。
在生物樣本中，蛋白質樣本分子質量動輒是數千道爾吞 (kDa)、數萬道爾吞 (10 kDa) 以上；受到離子束或電子束照射後，未必能成功脫附而游離，反倒常被熱能燒損、或因高溫而變質。常用的折衷方式是，利用酵素針對切位、讓大型蛋白質變成碎片形式，配合「小分子質譜技術」來量測。然而，由於分解後，各個碎片的游離訊號隨機、質譜片段不完整，加上完整蛋白的不易游離；在高度仰賴資料庫系統判讀時，不易拼湊原始樣貌、容易失誤。
二、完整蛋白大分子質譜技術
接下來具體介紹「完整蛋白大分子質譜技術」，該技術協助醫療檢驗或生物檢測，來對應到完整蛋白體學。我們先從物理科學的角度來著手，依序鋪陳質譜儀運作其特定機制的演進。最後，以檢測實作的過程，來一一說明如何提升完整蛋白大分子質譜的靈敏反應及解析能力。
1. 蛋白質質譜分析策略－完整蛋白質與水解蛋白
蛋白質是由基本結構單元胺基酸 (amino acids) 所構成的長鏈分子，它們是具有極特殊化學結構的有機化合物。目前在蛋白質質譜量測上可以分成兩種手段，一種是直接量測完整蛋白質 (intact protein)(9)，而另外一種則是將大分子蛋白質進行水解成胺基酸序列再進行質譜分析 (圖 2)。
圖 2. 從完整蛋白水解成胜肽片段。
過去由於質譜技術的限制，尚無法直接分析完整蛋白，常使用酵素水解手段針對高複雜度的蛋白質以形成較小的胜肽片段 (peptides)，這些胜肽包含數個胺基酸，而胺基酸平均質量為 110 Da (道爾吞)，每個胜肽質量則落在 500－3,000 Da 間(10)，而這個質量大小對於目前商用質譜儀為較合適的質量測試範圍。雖然水解的方式有機會讓樣本成功被質譜儀測得，但並沒有辦法對應到原本蛋白質完整形貌及或呈現蛋白質上的修飾物的質量，也因此在討論蛋白質體學角度時，常常遺漏點原始蛋白應具有的資訊。
要發展作為大分子質譜的蛋白質質譜，則是得逐步擺脫電子射束游離源，另外開發適合大分子的游離方法。若從質譜發展歷史來看，如 1980 年代，約翰·貝內特·芬恩 (John Bennett Fenn) 發展的電噴灑游離法 (electrospray ionisation, ESI)；暨 1985 年，田中耕一 (Koichi Tanaka) 發展的軟雷射脫附游離法 (soft laser desorption, SLD)，或同時期，弗倫茨·希倫坎普 (Franz Hillenkamp) 與邁克爾·卡拉斯 (Michael Karas) 發展的基質輔助雷射脫附游離法 (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)(11)。
將蛋白質質譜量測的方式進行分類 (表 2)，可以針對樣本種類還有游離方式選用合適的方法。在游離方法上，最常使用的是電噴灑方式 (ESI)，透過在毛細管施加高電壓，液態樣本經過噴灑後，由於電場作用還有噴出體積改變，噴出的液滴內會有攜帶不同電荷的帶電團。這樣的方式常使用於蛋白質樣本游離，然而由於噴出的價態複雜，液滴內可能包含多重質量分子，在圖譜判斷上譜峰較難直接判斷，常使用的後端質量分析器為三段四極桿 (triple quadrupole)、四極柱飛行時間質譜儀 (Q-Tof)、離子阱 (ion trap) 以及傅立葉轉換質譜儀 (Fourier transform MS, FT-MS)。三段四極桿、四極柱飛行時間質譜儀及離子阱，前兩種分析方式若處理蛋白質經過水解消化程序，可測得良好圖譜，而舊型離子阱則因為帶電粒子捕獲成效還有後續偵測器設計發展受限。傅立葉轉換質譜儀在 2 kDa 以下具有超高解析能力，缺點是分析時間長，在更大質量範圍的量測時間更長。
表 2. 臨床蛋白分子常用質譜分析方式(12)。
另一種游離方式則是基質輔助雷射脫附游離法，該方法常使用飛行時間質譜儀接在後段，呈現的圖譜雖然細節較少，但簡化游離樣態後大分子可被看到。然而，飛行時間質譜儀所搭載的飛行管體積龐大，若要更清楚解析，則需要更長的飛行距離，或使用反射式模式 (reflection mode)。
本篇將討論質譜儀中離子阱質量分析器，從 1980 年代中期起，離子阱質譜技術進一步商業化。游離源、分析器、偵測器被整合在一起；利用共振線圈產生高頻段的主要波形來驅動離子阱，以線性振幅掃描進行高解析小分子質譜(13-15)。偵測的大分子質量之所以受限，一般咸認是主要波形的電壓振幅，僅能調變一個數量級的緣故。
接下來的段落將帶領讀者了解哪些質譜儀的技術限制，造成面對完整蛋白質這類大分子量測時，還有需突破的地方並與讀者分享團隊研發技術上的設計理念。
2. 技術前沿一：射頻電四隅極矩離子阱
迴異於使用轉彎磁場 (magnet sector) 及飛行時間 (time-of-flight) 的分析機制，1953 年，沃爾夫岡·保羅 (Wolfgang Paul)，協同赫爾穆特·斯坦威德 (Helmut Steinwedel)，發明射頻電四隅極矩離子阱；對使用熱游離、或場游離電子射束，而衍生的游離原子，形成 (二維或三維的) 質量分析器 (mass filter) 或質荷比分析器 (mass-to-charge ratio analyzer)(16, 17)。1973 年，漢斯·格奧爾格·德默爾特 (Hans Georg Dehmelt)，協同戴維·瓦恩蘭 (David J. Wineland)，利用直流電四隅極矩，另外加上軸向磁雙極矩，形成自由電子阱，用來量測單一電子的磁矩。
圖 3. 離子阱示意圖(18)。
離子阱質譜儀 (ion trap) 原理是利用一個三維電場 (圖 3)，將帶電離子困住，透過改變電場讓不同質荷比的離子拋出離開電場，再來偵測訊號。進行質譜儀操作時，若需要針對特定質荷比離子進行分析，需要先認識電場中帶電離子的運動情形。質譜法需要討論到離子阱內帶電粒子的運動軌跡；在理想條件下，可用 Mathieu’s equation 描述 (公式 1)，若考慮到真實誤差項則可以將式子改寫加入 b¯ (ξ) 項 (公式 2)。
而 au 和 qu 則分別代表 
u：離子運動中徑向或軸向位移
2ξ：射頻電場中兩倍相角
e：電荷
m/z：質荷比
V：射頻電場的振幅
Ω：射頻電場中角頻率
U：直流電場偏置電壓 (DC offset)
b¯(ξ) ：存在真實情況的外界誤差
離子運動中 U 包含 u1 及 u2，其展開形式如下圖左，u1 及 u2 代表兩組行進方向相反的運動。Raymond E. March 所提出離子運動捕獲軌跡如下圖，離子在電場內運動可以分成上面方程式所提到的兩部分，長週期運動 (secular motion) 及微幅運動 (micro-motion)(19)。
圖 4. 根據 Mathieu 微分方程式標示出不同狀態下的離子運動圖。
以共振單頻時變場驅動電四極阱所捕獲的離子，在徑向、軸向的理想封閉運動軌跡，皆滿足 Mathieu 微分方程式。根據 Floquet 定理，除了與原週期驅動線性地相應的諧頻微幅運動分量，運動軌跡另含有一長週期的乘積分項。至於穩定運動軌跡的存在與否，則有賴於長週期、原週期兩者之間的特徵比值，或是各分量投影係數的聯立數值解。聯同徑向、軸向運動各自的週期特徵比值，則進一步形成判別運動軌跡是否穩定存在的二維相圖，標示其穩定區間。
3. 技術前沿二：質譜偵測的限制
考量傳統質譜或能譜的偵測，其仰賴高度靈敏的電子倍增管技術。高速的離子或電子入射、撞擊金屬電極，產生的若干二次游離電子量(20)，由電子倍增管或微通道板 (microchannel plate, MCP) 收集、在管內進行一連串撞擊，以 106－108 的數量級、倍增為時脈寬約 1 奈秒 (ns) 的電流脈衝；電流匯總進入法拉第盤、再由電荷量放大電路，搭配微分、積分的時序整形電路，形成上升時間約 1 微秒 (μs) 的電位脈衝 (圖 5)。
圖 5. 電子倍增管、前級阻抗變換電路、暨二次電子與入射離子動能的關聯。
然而，入射物質的離子或電子，其能量損失在低速撞擊時急遽下降，使得慢速的大型分子離子在撞擊金屬電極時，只能少量地、甚至無法產生二次電子，這間接形成質譜偵測的質量上限。
以及，高頻段的主要波形，搭配定頻調制的輔助波形，以振幅掃描的高解析小分子離子阱質譜技術由來以久。隨著阱內待測分子的質量逐漸提高，相對低速的離子能譜亦漸漸反映出可觀的耗散及擾動，意味著無法忽略大型分子離子在阱內受到流動氣體的大量磨耗，以及阱內離子彼此之間的頻繁干擾，這間接形成質譜偵測的解析上限。
此外，基質輔助雷射脫附，作為固態游離源，其樣本製備過程，本質為多成分溶液乾燥的相變化，其中非均質多相析出是最常見的樣本末態，致搭配最佳取樣點，來累積有效的倍增管偵測結果。樣本來源的提取，也得考究各式樣本之間游離效率的競爭、及阱內離子總電荷量的限制；而動態地、少量地逐次萃取細菌、組織細胞的各種蛋白質，亦得考究游離配方、不使樣本變質。這些種種形成樣本製備的流程限制。
4. 從樣本製備至質譜偵測
(1) 生物細胞檢體樣本提取
進行真實世界生物樣本質譜的最大挑戰，在於檢體本身即非常「複雜」。在複雜的生命系統當中，其內含成分往往不會只出現預期檢測的產物。以標準細胞株為例，經過標準培養程序後的細胞其細胞類型相同，但細胞內具有不同胞器結構還可能產生各種蛋白及代謝產物；此外，培養過程中所添加的培養基，裡面所添加的化學物質亦會保存其中。回到實際層面，更多臨床生物檢體例如血液、尿液或菌液，其複雜程度遠高於預觀測的量，因此在操作層面上，一開始處理樣本時，就需要一路考慮是否妨礙到最後端的質譜偵測程序。
檢體細胞的蛋白質分布是裏外皆俱。檢體破裂後的混合物一般並不利於直接地分析、檢索。一般在處理複雜樣本時，質譜儀前端會利用液相層析儀針對液體樣本進行分離，利用不同成分對 UV 光波長的吸收特性，可收取特定波段的部分樣本。另外，結合生化方式，亦可利用電泳膠體分離質量，電泳膠體所需時間較久且解析度較低，但仍能針對複雜樣品進行質量尺度的分離。
以細菌樣本為例，過去檢測方法為直接測量、或是破菌後量測。這個方法雖然有機會看到細菌內的組成，卻也伴隨著樣本複雜度的提升，而會妨礙質譜的完整偵測。筆者團隊認為，生物胞膜本身就是一個分離手段(21)。細菌結構從外至內，包含細菌外膜、細胞壁以及細菌內膜，膜主要為雙層磷脂層。有機溶劑可改變對雙層磷脂層的穩定性，改變細菌膜的屏障程度，逐步的提取內層成分。因此，依照蛋白質在檢體細胞從裡到外的分布來分次提取，會比使用液相層析循序來分次提取 更有利於生化反應的特徵比對。
該如何考量檢體蛋白質對特定比例溶劑的溶解程度、細胞膜因溶劑作用對其通透性的調節、以及細胞膜破裂的臨界極限？這會是藉由設想「提取時序的動力學」來開始，將有機溶劑濃度、連同浸泡作用時間，轉化成提取作用量；藉由作用量的逐步改變，動態地、少量地、逐次萃取細菌、組織細胞內外的各種蛋白質，避免成分複雜而妨礙游離過程 (圖 6)。
圖 6. 細菌、組織細胞內外各種蛋白質的提取動力學關係，暨關聯質譜示意圖。
(2) 游離樣本的製備
要如何認識大分子游離時，所謂的干擾因子？其通則來自於熱力學的相法則 (圖 7)。多成分樣本與基質混合的均勻溶液，在藉由溶劑揮發而乾燥時，由於樣本大分子與基質小分子「不互溶特性」，往往是多相不均地析出的末態；乾燥時各相成分分布的差距呈現兩極化，除了在高度異質的樣本盤邊界會是多相平均混合形成的最佳取樣點外，樣本盤絕大部分其他乾燥地點的 「樣本／基質」比例，並不利於精準游離。
圖 7. 利用熱力學相法則討論質譜上樣程序中樣本與基質的分布。樣本大分子與基質小分子因不「互溶」，往往是多相、不均勻地各自析出。最下方標示的是 「急凍淬冷慢速回溫」 的材料熱力學製程。
要製備最佳取樣末態，在考量「急凍淬冷慢速回溫」的材料熱力學製程之外，一般採取以均勻快乾樣本鋪陳於飽和基質的雙層製備程序。檢體蛋白質樣本，易因環境變動而變質；在配製均勻快乾樣本層時，得一併注意搭配的小分子溶劑，其酸鹼調節及溫度是否會使蛋白質變性。
(3) 相位調制離子阱質譜偵測
相位調製動力學主要討論阱內離子的運動，在討論上明確定義在主要波形的「相位」上；在頻率固定，且無外來干擾時，其慣性運動為諧頻微幅運動與長周期運動相乘的組合。但在工程操作上，仍然得考量如何調整或控制氣體流量暨阱內離子量的問題，這相當於阱內離子也面臨著環境耗散暨相互擾動的既定事實公式 (2)。在動力學上，外來干擾帶給慣性運動的誤差是以兩者在時序上的耦合摺積來估量。若將先前方程式提到的誤差拆解來看，可分成以下來自不同層面的誤差累積，可將原本的公式 (2) 及公式 (3) 擴充成相關細項公式 (4) 來考慮 。
b¯mod : conjunction modulation; b¯error : nonlinear/gas damping/ion-ion interaction; b¯reset : dispersion; cI & cII : preset for the off-set.
1. Nonlinear：因加工或組裝的誤差使離子阱有些不對稱。
2. Gas-damping：質譜儀目前氣壓設定在 10-3 至 10-4 mTorr，在腔體內仍存有氣流使離子運動遲滯。
3. Ion-ion interaction：電場內帶電離子之間仍存有離子間作用力。
4. Conjunction：等相位銜接點，人工外加調制。
5. Dispersion：迅速變頻。
6. Auxiliary：輔助時變電場。
傳統小分子的高頻慣性有利於將誤差降低至外來干擾的期望值。對於低頻的大分子運動，則是在主要波形嵌入長週期性的等相位銜接點 (圖 8)，反覆地微量修正處於非平衡位置的分子其運動相位、使其相位趨於同步(22)。
圖 8. 射頻電四隅極矩離子阱等相位銜接點調制的機制表達示意圖。
對於無可避免的耗散與干擾，會進一步在主要波形引進短期、不定的絕熱升頻，來迅速地消彌長期累積的相位誤差，重新調整運動的初始相位。因此，循序地針對特定質荷比的離子運動相位，進行恰當地調制及重置，可以讓一群相同質荷比的離子逐漸運動同步、無延遲地集中拋出被偵測 (圖 9)。
圖 9. 細胞色素 C 的雙層製備程序，及不同的質譜程序之差異。恰當的調制，不衍生共振、會讓譜線的延遲 (離子群運動的耗散) 消失、顯示更多樣本細節；伴隨的價數統計分布亦相應集中。線性偵測的訊號同時可供線性與非線性表達。(a) 晶相照片：第一層為基質芥子酸 (SA)，第二層則為樣本溶於 30% ACN；(b) 無調制與 (c) 有調制的質譜 (線性與非線性) 對照及相應的離子價態分布直方統計。
(4) 線性電荷偵測器
為突破倍增管在大分子偵測的質量限制，作法是直接以法拉第盤收集由分析器拋出的離子團、讓極小數值的電容瞬時累計其電荷量；並搭配極大數值的並聯電阻 (圖 10)，讓感應到的電位差非常緩慢地放電衰減。形成急速變動、遲緩回復的特徵訊號，來對應瞬時發生的離散事件 (圖 11)(23)。
圖 10. 線性偵測基本電路改良自傳統電子倍增管的一小段前級電路－阻抗匹配設計
圖 11. 偵測器相應的基本電路測試、完全吻合線性偵測設計的漸近公式。離散電荷的偵測是以急速上升的電位變動來顯示；連續電流的變動則是緩慢地充放電起伏。
(5) 數據的後級處理
因為電子倍增管的運用，質譜使用者習慣針對尖細的譜峰進行判讀，倘若訊號不是尖細容易判讀時，這時後端數位擷取的數據要先進行下列程序：
i. 整流摺積：使用數值外插法來近似微分運算，去除電容放電的拖曳特徵，並將偵測的電位差、轉換單位成為電荷數目。
ii. 相關摺積：使用代表瞬時共振反應的勞倫茲分布，強化電容迅速充電的上升前緣，形成具有局部上升特徵的局部起伏。
iii. 濾波摺積：將遍佈任何時刻的隨機變動，以一長段特定分布 (例如，高斯分布) 的前後時序內、幾近於零的期望值來取代。或是，小波分解。使用局部小波投影，對數據進行 訊號、背景、雜訊的各式分解及重組。
除了數位擷取數據的處理，更進一步還可因應質譜及能譜中，對應各式游離游離條件，以及對超長時序中不定且微弱的線性偵測訊號進行討論：
iv. 針對游離事件的隨機分布進行疊加統計 (直方長條圖) 來表徵游離效率，以及判斷游離來自臨界電場效應 (卜瓦松分布，Poisson distribution) 或是反覆碰撞效應 (高斯分布)。
v. 針對游離事件的譜線分布進行權重歸一，冪次乘積，多次累加，加權取樣，峰值截尋；表徵對應游離事件的特定關聯。
5. 大分子蛋白實作程序細節－以蛋白質電泳標準品為例
使用離子阱質譜儀，進行細菌、組織細胞等檢體的蛋白質全質譜。以未染色、未經酵素剪切、多種大分子量混合的蛋白質標記 (protein marker) 之電泳標準品 (protein ladder) 為實驗對象。該樣本包含多個相異標的蛋白質，其質量皆為千道爾吞 (kDa) 等級；在膠體電泳實驗中，於通電的電泳槽，利用蛋白質帶電量或分子量的大小將蛋白分開。蛋白電泳標準品是多段質量蛋白的混合試劑，在不同濃度比例的凝膠中，可分離並對應到相對質量。(電泳圖示，蛋白質電泳標準品於不同濃度比例凝膠的分離情形及對應質量)
蛋白質電泳標準品以純水稀釋後，利用質譜配樣用溶劑 (1% TFA / ACN) 進行酸鹼值調整，避免蛋白質分子聚集 (protein aggregation)、蛋白質錯誤摺疊 (protein misfolding) 或蛋白質變性 (protein denaturation)。採取雙層製備程序：分別於第一層底層將基質 (SA / acetone) 進行飽合上樣，第二層上層則配置調整後的電泳標準品樣本；雙層配樣方法的用意，在於確保均勻分布的每個待測樣本分子、其周遭圍繞著足夠多的基質、能被雷射游離後的大量基質離子傳遞質子而游離。
實驗使用前述提到的離子阱質譜儀 (AMS-200, AcroMass Tech. Inc) 來進行量測。於質譜掃描流程的設計上，利用「等相位調制」來同步阱內各離子的運動相位、切換頻率、以及補償各種磨耗及干擾。使用固定振幅、分段變頻 (圖 12)，來進行大範圍 (5 k－180 kDa) 的離子質量掃描。
圖 12. InTrap MALDI Mass Spectrometer, AcroMass Tech. Inc.。
線性偵測得到數據，在時序上進行整流、相關、濾波等褶積、及歸一化後，會以多筆資料整併、統計的方式來確認譜線分布。由於在游離數量上，略小蛋白離子遠遠多於大蛋白離子；在全質量區段掃描之後，會再重新確認質譜的區塊分段，以分段質譜進行多筆整併，再多段合併、完成全質量區段質譜。
已知電泳標準品是多樣、大量的樣本混合物，其單一全質量區段掃描的質譜顯示，阱內絕大多數捕獲的離子是游離效率較高、而質量較小的離子。如同一般經由簡易採樣、而成分複雜的生物樣本，其單一全質量區段掃描的質譜大多只顯示游離數量可觀，佔據阱內多數空間的較小樣本分子離子，造成小質量區出現譜峰多，但大質量區幾近無訊號 (圖 13)。
圖 13. 利用離子阱質譜儀對電泳標準品以等質量差掃描方式進行質量全區掃描。該圖質譜掃描範圍為 5 kDa 至 180 kDa，利用等質量差掃描方式進行掃描 30 筆訊號進行合併。大部分譜峰出現在 5 kDa 至 10 kDa 附近，而在大質量區則無法出現偵測訊號。
改採質量區塊分段掃描後，各區塊質譜皆可顯示該區塊內所捕獲的離子；恰當地調整區段、可以合併成完整的質譜 (圖 14)。各質量區段的訊雜比、解析度，則有賴質譜掃描，於對應的頻率變遷前後，如何安排合適的相位調制、來減少緩衝氣體的磨耗及離子彼此之間的干擾。
圖 14. 利用離子阱質譜儀對電泳標準品以等質量差掃描方式進行質量分段掃描。該圖質譜掃描範圍為 5 kDa 至 180 kDa，利用分段掃描方式，在每段進行每次 30 筆的掃描，每段採等質量差掃描方式，而小質量區與大質量區的等質量差數值，質量越大離子動得更慢，因此等質量差值 (difference of mass value) 也需增加。利用分段掃描方式，可看到蛋白質電泳標準品在質譜儀測試下，會呈現區段的呈現。
這相當於討論不同質量區段的質量掃描速率或頻率變動間距，與調制手段的對應關係。舉例來說，低質量區段對應的是高頻段時變場，其調制迅速、有效；但相同的調制模式，在進入高質量區段對應的低頻段時變場，則可能會逐漸顯得緩慢而失效。
因此，採取設定掃描速率來進行質譜掃描，在超高質量區段會面臨高掃描速率、及調制量過少的矛盾。得另採取設定質量差距的方式來進行補救。對應標準樣品混合物的電泳分布，可以調整及設定各個合理的質量區塊分段，搭配合理的調制、及跳頻的質量差距，來逼近高解析的大分子質譜。
承前段所提，複雜樣本在上機前的分離程序有助於後續質譜的分析，若接續實驗若將蛋白質電泳標準品先經過電泳分離後，切下特定質量片段後，以溶劑溶出 (0.1% TFA/ACN) 後再進行量測，可得到更集中且高游離的質譜譜峰 (圖 15)。
圖 15. 利用離子阱質譜儀電泳分離後切膠溶出後蛋白樣本進行質譜分析。(a) 將蛋白質電泳標準品進行電泳分離後，會於凝膠上分離成不同大小的條帶分布。將 90 kDa 位置藍色條帶切下後，利用溶劑溶出裡面 90 kDa 大小樣品，再進行質譜分析。(b) 藍色部分為原始蛋白質標準品，而綠色部分則為膠體分離切下後的樣品，在一樣的質譜程序中，經過初步分離可以得到較高的游離量，其譜峰也較為集中於 2 個主要譜峰，而未經原始的標準品則出現 4 個譜峰分布。
三、結論
藉由在「線性電荷偵測器」、暨「相位調制質譜法」的技術創新，搭配樣本製備的相變化學理，復古的射頻電四隅極矩離子阱可以突破質量範圍、解析能力、樣本製備等等限制，來分析完整蛋白質質譜。蛋白質電泳標準品作為練習範例，初步演示了生物檢體細胞之完整蛋白分子質譜技術。未來將進一步行的是抗體蛋白修飾指紋質譜、以及細菌或細胞蛋白質全質量範圍質譜掃描。