循環腫瘤細胞捕捉技術在癌症診斷之應用
The Application of Circulating Tumor Cells Detection in Cancer Diagnosis
癌症為國人十大死因之首，癌症的死亡率與是否能早期診斷息息相關。目前診斷癌症的主要方式為病理切片與影像判讀，癌症因子生化檢測方式則因為其靈敏度低而仍需搭配影像判讀輔助診斷，然而這些方法對於早期診斷癌症仍有其限制。有鑒於此，液態活檢在過去十年發展逐漸成熟，藉由捕捉釋放到血液中的癌細胞或分子，早期診斷癌症的發生，提高病患的生存機會。這篇文章介紹了一種液態活檢技術，用以偵測血液中的循環腫瘤細胞。此技術能夠藉由捕捉血液中的癌細胞，協助醫生診斷癌症以及後續的治療。
Cancer causes the most death in Taiwan. The mortality rate is correlated to the cancer stage. The earlier cancer diagnosed is the higher patient survival rate. Major cancer diagnosis methods are biopsy and image examination. The sensitivity of tumor marker detection for cancer diagnosis is very low. It needs to combine with image examination. However, these methods are limited in early cancer diagnosis. In the past decade, the liquid biopsy development is growth. According to the cancer cells or molecules detected in the blood, it helps to diagnose cancer earlier. Herein, we introduce a liquid biopsy method, circulating tumor cells (CTCs) detection. This method is used to detect cancer cells in the blood and help cancer prognosis and treatment.
一、前言
1. 癌症的偵測與液態活檢
癌症的檢測與追蹤有許多種方法，主要可以分為侵入性 (invasive) 與非侵入性 (non-invasive) 兩大類。侵入性方式為透過手術、探針 (needle)、內視鏡 (endoscopy) 的方法到達病灶位置直接取得該位置的組織或液體。取得的組織樣本則會進行病理切片染色檢查 (biopsy)(1)。此種方法能夠最準確的診斷癌症。生物切片屬於侵入性行為，在癌症治療的過程中，因為此方法癌症病患的身體負擔過大，做為追蹤癌症的進程則不適用。目前常規非侵入性用於癌症診斷的方式可以分為兩種，第一種為影像檢測 (image tests)。影像檢測包含 X 光拍攝 (X-Ray)、電腦斷層掃描 (computerized tomography, CT)、核磁共振 (magnetic resonance imaging, MRI)、超音波掃描 (ultrasound) 等方法(2)。這些影像檢測方式可以快速地觀察到癌症發生的有無，甚至在癌症發生初期，腫瘤體積還小的時候，也可以很準確的觀察。影像檢測用於早期的癌症診斷與預後的觀察都非常的方便，但是部分的影像檢測因為輻射量的考量，或是顯影劑的過敏反應等副作用，故也一定程度的限縮此一檢測方式在臨床上的應用。第二種非侵入性的癌症診斷方式為實驗室分子檢測 (lab tests)，偵測目標主要為血液或尿液等體液中的蛋白分子，癌症發展的過程中，會造成某些蛋白質，又稱為癌症因子的濃度在血液中升高，藉由偵測血液分子濃度，推測罹患癌症的機率。國內目前常用的檢測癌症因子有前列腺癌的前列腺特異性抗原 (PSA)、卵巢癌的癌症抗原 125 (CA 125)、肝癌的甲型胎兒蛋白 (AFP) 等(3)。但目前常用的這些癌症因子的檢測的敏感度偏低，容易造成偽陽性的結果。由於其高偽陽性的特性，故這些分子檢測的結果並不能直接做為癌症診斷的依據。都會再搭配影像檢測結果幫助癌症的診斷，故實驗室分子檢測一般多作為輔助診斷的工具。
過去十年來有一項非侵入性的癌症檢測方式逐漸的成熟，此項技術稱為液態活檢(liquid biopsy)(4)。液態活檢目的在偵測血液或尿液中的循環腫瘤癌細胞 (circulating tumor cells, CTCs)、游離 DNA (cell free DNA, cfDNA 或是 circulating tumor DNA, ctDNA)、外泌體(exosomes)。相比較於上述的非侵入性的癌症檢測或追蹤方式，液態活檢的優點在於可以觀察到癌細胞的多樣性，傳統的實驗室血液生化檢查，或是影像檢測，只能判斷出癌症病情是否有變化，然而液態活檢在追蹤癌症病情過程中，可以藉由癌細胞表面抗原，或是血液中 DNA 的變化，提前推測癌症是否有惡化的可能性，或是對於用藥產生抗藥性的現象。再則對比精確度高的傳統生物切片檢測方式，液態活檢的檢驗優點在於其方便性。與傳統生物切片相同，液態活檢也可以檢測癌細胞的標誌蛋白分子，進而判斷癌症現在病程的狀況，但是病理切片必須透過侵入性的方式取得部分癌組織後進行判斷，而液態活檢只要幾毫升的血液檢體便能夠偵測癌症的病況，並且為非侵入性的手法，因此可以在減低病人負擔的狀況之下，定期的抽血追蹤癌症病情的變化(4)。
2. 循環腫瘤細胞
最初癌細胞生長發育所形成的腫瘤稱之為原位癌 (primary tumor)，原位癌的細胞會持續的複製生長，而腫瘤細胞在發展過程中，為了獲得足夠的養分，會刺激血管增生(angiogenesis)，幫助癌細胞的養分交換。加上腫瘤細胞在發展的過程中，細胞特性會不斷地改變，因此有部分的癌細胞從不具有侵犯血管的能力轉變成能夠侵犯血管。這群具有侵犯血管，隨著血液循環至全身各處的細胞稱為循環腫瘤細胞 (circulating tumor cells, CTCs)(5)，如圖一所示。大部分的循環腫瘤細胞進入到血液循環之後很快地就會死亡凋零。然而有少部分的細胞在循環的過程會再次的侵犯血管，離開血管後的癌細胞便會在新的器官產生新的腫瘤組織。從原位癌的位置離開至新的位置產生腫瘤的過程稱為癌轉移 (metastasis)。在已發表的文獻中皆指出，當血液中的循環腫瘤數目較高時，較容易產生癌症轉移的風險，而且病人的存活率也會隨之下降。
圖 1. 循環腫瘤細胞生成以及轉移之過程。
3. 捕捉循環腫瘤細胞之方法
根據循環腫瘤細胞的特性，主要可以將循環腫瘤細胞捕捉方法分為三大類：
1. 磁珠免疫親和力：因為循環腫瘤細胞表面抗原的組成與血液中的免疫細胞有所不同，利用有接合抗體的磁珠與循環腫瘤細胞表面結合，循環腫瘤細胞表面上因為有許多的磁珠沾附，之後利用磁鐵將細胞吸附於收集細胞的管壁上。未被吸附的免疫細胞則會被沖洗排出。收集後的循環腫瘤細胞則會利用流式細胞儀分析、免疫螢光染色、qPCR 等分子生物學方式進行細胞特性分析(6)。
2. 細胞大小分選：根據細胞型態的研究，循環腫瘤細胞相較於免疫細胞有較大的核質比，同時循環癌細胞的大小平均在 10 微米，而免疫細胞則落在 5 微米。根據這樣的細胞特性，可以利用不同孔徑 (6 到 9 微米)的生物過濾膜進行細胞分選，留在膜上的細胞則再進行免疫螢光染色，觀察這些細胞是否有表現癌症標誌蛋白(7)。
3. 微流道：微流道系統係指將血液或是處理後的周邊血細胞經由流體的方式流過特殊設計的晶片或是玻片進行循環腫瘤細胞的捕捉。微流道結合細胞大小的捕捉方式則是在通道的寬度進行變化，這種捕捉方式會在流道上設計多個分岔點，每個分岔點會有窄跟寬的通道選擇，由於免疫細胞的體積偏小，因此細胞多會往較窄的通道流動，而循環腫瘤細胞則只能往較寬的通道流動，藉由多個分岔點的篩選後，最後收集到的細胞便會以癌細胞居多，另一種方式係為微流道結合免疫親和力的捕捉方式，是在微流道結構上接上能夠捕捉癌細胞表面標誌蛋白的抗體，當循環腫瘤細胞流過之後，會與晶片表面抗體結合，而被留置在晶片表面，非循環腫瘤細胞則會因為流體的帶動而被沖走，不被留在晶片上方。微流道捕捉細胞基本原理雖與上述兩者相同，但微流道晶片的構造，可直接提供使用者能夠進行多種的生物分析行為，例如細胞染色觀察、單細胞挑選、細胞培養等實驗皆可在微流道晶片上進行(8)。
二、CellRevealTM 系統循環腫瘤細胞捕捉原理
CellRevealTM 系統結合微流道免疫親和力、半導體晶片製程、人工智慧影像辨識分析、單細胞挑選技術等技術，所發展出獨特的循環腫瘤細胞檢測分析系統。整個流程可以分為三個階段：
1. 細胞捕捉與染色
細胞捕捉上，採用微流道結合免疫親和力的方法，不同於其他系統的微流道設計，其利用過往在半導體晶片製程的經驗，利用金屬輔助化學蝕刻法 (metal-assisted chemical etching, MACE) 進行流道的修飾，修飾後的流道會形成許多的奈米的柱狀結構，此奈米結構上帶有皮米級微孔 (如圖 2)，這樣的晶片的結構增加了晶片整體的表面積，同時增加了與細胞接觸的機會。當此多孔結構完成之後，會在表面塗佈上一層 polyethylene glycol-biotin (PEG-biotin)，待塗層完成之後，最後再加入 streptavidin 與 biotin 進行接合，完成此步驟，表示此 VBioChip 晶片已經可以進行細胞捕捉 (圖 2)。
圖 2. 微流道晶片的構造。
循環腫瘤細胞存在於人體的血液中，因此要進行循環腫瘤細胞的捕捉必須要進行血液細胞的分離，由於循環腫瘤細胞的細胞比重與周邊血單核球細胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 相同，故利用細胞密度梯度分離方式，先將循環腫瘤細胞與 PBMC 一起分離出來，避免紅血球與血小板的干擾。循環腫瘤細胞多屬於表皮細胞特性的細胞，因此細胞表面的標誌蛋白 (protein marker) 與 PBMC 上的免疫細胞特有的標誌蛋白不同。根據此原理，我們選定了循環腫瘤細胞表面特有蛋白 EpCAM 做為目標物。利用 biotin-anti-EpCAM 的抗體結合到循環腫瘤細胞表面後，將全部的細胞投入 VBioChip 晶片，循環腫瘤細胞因為細胞表面的抗體上的 biotin 與晶片表面的 streptavidin 結合後便會將細胞留在晶片表面。
當所有的細胞通過 VBioChip 晶片後，下一步是要檢測留在晶片上的循環腫瘤細胞的數目，此時在晶片上有著因為抗體結合的循環腫瘤細胞也有因非特異性接合留在晶片上的免疫細胞，利用免疫螢光染色 (immunofluorescence staining) 的進行這兩種細胞的區隔。循環腫瘤細胞會依癌種的不同，選擇不同的癌症標誌蛋白進行癌細胞的標定，而免疫細胞則選擇所有類型免疫細胞皆會表現的 CD45 進行標定。
2. AI 人工智慧細胞影像辨識
免疫螢光染色完成後的晶片，利用螢光顯微鏡進行細胞拍攝，透過玻片載台定位系統以及自動拍攝的軟體 (CytoAcqImage, CAI)，此軟體能夠協助進行整個 VBioChip 晶片拍攝，節省操作者使用時間。拍攝完畢，則須根據拍攝出來的影像進行判讀。血液中能夠捕捉到的循環腫瘤細胞數目相當的少，若是以人工判讀螢光染色結果，會相當的耗時，因此透過人工智慧細胞影像軟體 (cell analysis tool, CAT) 協助使用者判讀影像結果。此軟體結合細胞型態演算法 (cell phenotype algorithm, CPA) 與機器學習 (machine learning) 兩種特性識別循環腫瘤細胞。CAT 的開發分為了兩個階段，第一階段，利用數學模式進行的機器學習的演算，以數學模型進行細胞的挑選時，需要先找出癌症細胞或免疫細胞的特性，根據細胞特性挑出循環腫瘤細胞。然而利用數學模式進行特性挑選並不適用於所有的癌症細胞，因為不同的癌細胞有不同的特性，需要根據癌種進行不同的設定，導致軟體的使用較不方便。故第二階段的開發，利用類神經 (convolutional neural networks) 的方法進行機器學習的演算，類神經的演算利用數層的類神經模組，進行細胞特性的挑選，這樣的演算過程，並不會受到癌種不同而有所限制。因此，以現有的識別方法將可以快速地幫助使用者從晶片上挑選循環腫瘤細胞。
3. 標定細胞挑選後續分析
前文提及液態活檢可以透過循環腫瘤細胞、游離 DNA、外泌體等分子進行癌症檢測，本研究團隊選擇以循環腫瘤細胞作為偵測對象進行研究開發在於其後續的應用面。游離 DNA 或是外泌體的檢測，後續只能針對單一種分子進行分析，例如 DNA、RNA、蛋白質等分子。然而循環腫瘤細胞的後續應用則較為廣泛。循環腫瘤細胞在被捕捉後，可針對單一細胞進行 DNA、RNA、蛋白質的分析，如果是透過活細胞捕捉與觀察，確定的循環腫瘤細胞還可以進行培養，培養後的細胞可以進行藥物測試與多體學 (omics) 的分析。為了能夠準確地從晶片上將循環腫瘤細胞挑出進行後續分析，自動化微組織細胞分選儀 (cell picker) 會根據拍攝時所進行的定位資料，自動找到細胞的位置，確定細胞位置之後將細胞挑出進行分析。目前本研究團隊與威健實業股份有限公司及儀科中心合作進行細胞基因定序與抗藥基因的檢測開發。
三、癌症診斷之應用
目前研究團隊與多家醫療院所合作進行循環腫瘤細胞檢測的開發，已經於肺癌 (lung cancer)、肝癌 (liver cancer)、卵巢癌 (ovarian cancer) 等多個癌種進行研究。近年來於卵巢癌的研究較為完善，下面便以卵巢癌的檢測與後續分析為例，介紹循環腫瘤細胞檢測技術如何應用於癌症診斷。
1. 卵巢癌循環腫瘤細胞檢測之開發(9)
(1) 尋找可捕捉卵巢癌之標誌蛋白
上述文章有提到用於捕捉循環腫瘤細胞的標誌蛋白為 EpCAM，然而當利用卵巢癌細胞
株 SKOV3 進行實驗測試時，發現單獨使用 EpCAM 抗體時細胞平均捕捉率只有 48% (圖 3)。
故表示只有使用 EpCAM 時不能有效地將卵巢癌細胞捕捉於晶片上。根據文獻指出，多數的卵巢癌細胞會同時表皮性 (epithelial) 與間充質性 (mesenchymal) 的標誌蛋白於細胞表面(10)。EpCAM 屬於表皮性的標誌蛋白，因此選擇再配合另外一種間充質性的標誌蛋白增加細胞捕捉率。N-cadherin 屬於常見的間充質性的標誌蛋白，文獻也指出 N-cadherin 對於卵巢癌細胞的生長調控扮演重要角色(10)。因此決定利用 EpCAM 與 N-cadherin 作為捕捉卵巢癌細胞的標的。實驗驗證得知，利用辨認 EpCAM 與 N-cadherin 的抗體進行卵巢癌細胞捕捉，平均捕捉率大大的提升至 90%。因此決定在臨床實證時，以 EpCAM 與 N-cadherin 作為捕捉卵巢癌循環腫瘤細胞之標的。利用不同數目的卵巢癌細胞株進行細胞捕捉的實驗，當細胞數目小於 50 顆時，細胞株依舊能夠有效的被捕捉。
圖 3. 卵巢癌細胞株 SKOV3 捕捉實驗。
(2) 尋找可辨認循環腫瘤細胞與免疫細胞的標誌蛋白
確定捕捉循環腫瘤細胞的標的後，接著要尋找能夠分辨免疫細胞與卵巢癌細胞的標誌蛋白。前述已經有說明免疫細胞可以利用 CD45 表面蛋白進行辨認，接著要尋找能夠辨識卵巢癌細胞的標誌蛋白，上述有提到卵巢癌細胞表面多同時表現表皮性與間充質性，如果利用表皮性的蛋白質 EpCAM 作為辨識用標的時，會同時在良性的巧克力囊腫或惡性卵巢癌的病人血液中分離到的循環腫瘤細胞上偵測到 (圖 4)，因此無法有效的區分病人是否患有癌症。如同選擇捕捉循環腫瘤細胞抗體，要從間充質性細胞特有的蛋白質著手。具有間充質性特性的細胞通常也會表現幹細胞 (stem cell) 的特性，同時文獻指出幹細胞特有標誌蛋白 CD13 對於卵巢癌細胞的發展進程扮演重要角色(11)。因此測試 CD13 是否適合作為區分良性或惡性腫瘤的標的。實驗驗證 CD13 只會表現於卵巢癌病患分離到的循環腫瘤細胞，在巧克力囊腫病患分離到的循環腫瘤細胞則不會表現 CD13。因此可以利用 CD13 作為辨識卵巢癌細胞的標誌蛋白 (圖 4)。
圖 4. (a) 巧克力囊腫與 (b) 卵巢癌循環腫瘤細胞免疫螢光染色結果。
(3)臨床研究之分析
在確認捕捉與辨識卵巢癌循環腫瘤細胞標誌蛋白後，便要收集臨床檢體驗證這樣的實驗設計是否能夠輔助臨床判別卵巢癌的病患。本公司與台安醫院合作進行研究驗證，樣本分別為健康人 (未檢出良性瘤或是卵巢癌) 10 位、良性腫瘤患者 (巧克囊腫或是畸胎瘤 (teratoma)) 5 位、卵巢癌患者 8 位。以有表現 EpCAM 的細胞計數，可以發現良性腫瘤患者中有三位檢測到循環腫瘤細胞，偵測顆數從 0 到 3 顆不等。卵巢癌患者 8 位皆有偵測到循環腫瘤細胞，偵測顆數從 1 到 19 顆不等 (圖 5)。若是以表現 CD13 的細胞計數，良性腫瘤患者皆未檢測到循環腫瘤細胞，卵巢癌患者則有 5 位偵測到 CD13 表現的循環腫瘤細胞，偵測顆數從 1 到 9 顆不等 (圖 5)。健康人 10 位皆檢測不到表現 EpCAM 或是 CD13 的循環腫瘤細胞 (圖 5)。結果顯示在卵巢癌的患者中皆有表現 EpCAM 的循環腫瘤細胞，同時有超過一半的患者同時有表現 CD13 的循環腫瘤細胞被偵測，因此推測 CD13/EpCAM 可以用為輔助診斷卵巢癌的一項工具。
圖 5. 循環腫瘤細胞數目偵測結果。
2. 卵巢癌循環腫瘤細胞基因體之分析(12)
當循環腫瘤細胞被晶片捕捉後，可以進行多項的細胞後續分析，例如基因體學 (genomics)、RNA 表現量差異 (RNAseq)、蛋白質體學 (proteomics) 等分析。尋找癌細胞的基因突變點是許多藥物開發的目標，例如 EGFRL858R 便是最有名的例子。然而從 DNA 的樣本來自血液、原位癌處、循環腫瘤細胞是否能夠得到相同的基因突變的圖譜依舊未知，因此研究團隊與彰化基督教醫院合作，利用上述開發捕捉卵巢癌的抗體試劑進行卵巢癌患者循環腫瘤細胞的偵測，挑選兩位病患進行原位癌細胞與循環腫瘤細胞的 DNA 樣本萃取，並透過全基因體放大技術 (whole genome amplification, WGA) 將少量的 DNA 檢體放大之後，進行全外顯子定序 (whole exon sequencing)。第一位病人檢體的結果中，只有一個基因 GID4 是在原位癌與循環腫瘤細胞中皆發現相同的突變點，然而此基因並未有文獻指出與癌症有相關聯 (表 1)。而其他的基因突變則只發生在原位癌處或是循環腫瘤細胞的 DNA 檢體。相同的情況也發生在第二位病人的檢體中，原位癌細胞與循環腫瘤細胞的突變基因圖譜完全不同 (表 2)，其中包含了不少的致癌基因，例如 TP53、NOTCH2、PIK3R1 等基因。結果顯示癌細胞在發展的過程中會呈現不同的細胞族群，從單一位置進行 DNA 序列檢測而進行用藥，可能會導致部分癌細胞無法精確殺死，而循環腫瘤細胞的後續分析能夠提供更詳細的細胞基因圖譜，協助臨床對於突變基因用藥指引。
表 1. 病患一之突變基因表。
表 2. 病患二之突變基因表。
四、結論
精準個人化醫療為全球未來的生技產業發展重點，癌症的精準醫療在於透過分析基因序列，癌細胞蛋白質表現量等不同的分子表徵，進而為每位病人設計客製化的療程計畫。若要獲得相關的資訊就必須採樣癌細胞進行分析，傳統取得癌細胞的方式乃是透過侵入性方式直接從病灶處進行採檢，然而此種方式無法隨時取得進行追蹤。液態活檢技術的發展彌補了傳統取樣癌細胞的缺點。本研究團隊所開發的循環腫瘤細胞捕捉檢測技術，能夠有效地捕捉血液中的癌細胞，藉由追蹤捕捉到的癌細胞數目。將來可以搭配現有追蹤癌症進程的方法，如CT、MRI、超音波等方式輔助醫師判斷癌症的進展。待收集更多臨床數據後，能夠直接透過循環腫瘤細胞數目的多寡及表現蛋白特性，協助治療預後的追蹤。另外未來也會針對捕捉後的癌細胞進行癌症藥物標靶對象的檢測，例如 PD-L1、EGFR-L858R 等蛋白質。藉此提供後續不同層次的分子分析，協助醫師用藥指引，達成個人化精準化醫療目標。